矮秆蓖麻天冬氨酸蛋白酶基因的克隆、表达及蛋白纯化

作者：王双; 李国瑞; 黄凤兰; 陈永胜^*

来源：中国生物制品学杂志, 2020, 33(10): 1122-1127.

DOI：10.13200/j.cnki.cjb.003166

• 蓖麻
• RcAP基因
• 基因表达
• 蛋白纯化

目的克隆表达矮秆蓖麻(Ricinus communis L)天冬氨酸蛋白酶(aspartic protease,AP)基因(RcAP)并进行蛋白纯化。方法 Q-PCR法验证高秆及矮秆蓖麻六叶期叶片RcAP基因表达量;提取矮秆蓖麻六叶期叶片总RNA,PCR扩增RcAP基因,克隆至pETM30载体中,构建重组表达质粒pETM30-RcAP[含谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-Stransferase,GST)标签],转化至E.coli DH5α感受态细胞中,优化IPTG诱导浓度及温度,SDS-PAGE分析目的蛋白的可溶性;采用亲和层析纯化重组蛋白GST-RcAP。结果矮秆蓖麻RcAP基因表达量为高秆蓖麻RcAP基因的3.7倍;经PCR及双酶切鉴定,重组表达质粒pETM30-RcAP构建正确;最适诱导条件为0.1 mmol/L IPTG 16℃诱导;重组蛋白GST-RcAP以可溶形式表达,相对分子质量约为62 000;纯化的重组蛋白GST-RcAP浓度为6 mg/mL。结论成功构建了重组表达质粒pETM30-RcAP,获得了可溶性重组蛋白GST-RcAP,本研究为解析RcAP蛋白晶体结构、探索矮化基因与表型的联系奠定了理论基础并提供了试验依据。

• 单位
  内蒙古民族大学