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摘要
目的 建立m6A特异性烯丙基标记测序(m6A-selective allyl chemical labeling and sequencing,m6A-SAC-seq)实验方法体系，在单核苷酸分辨率水平对RNA的N6-甲基腺苷(m6A)修饰进行检测。方法 m6A烯丙基标记测序(m6A-SAC-seq)使用特异性甲基转移酶MjDim1对m6A添加烯丙基标记成为N6-烯丙基-甲基腺苷(am6A)，使用I2处理产生N1,N6-环化腺苷(A)产物，在逆转录时引入突变，从而实现在单核苷酸分辨率水平的检测。通过HPLC法纯化甲基转移酶MjDim1，使用探针及液相色谱-质谱联用系统(LC-MS/MS)检测m6A的转换率，计算MjDim1活性作为质控。提取样品RNA，用烯丙基标记m6A，并用m6A-SAC-seq技术构建文库，测序后通过数据分析得到m6A位点信息，通过标准曲线校准计算得到m6A的含量。结果 m6A-SAC-seq处理后，HIV逆转录酶识别环化的am6A位点，引入突变，但附近未修饰位点不发生突变。通过特定的A突变成T/C的突变位置(A to T/C)来识别m6A位点，并添加内参探针，用标准曲线来定量m6A含量。结论 m6A-SAC-seq技术仅需30 ng的mRNA或去除了rRNA的总RNA样本就可以实现m6A位点在单核苷酸分辨率水平的检测。
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