重组人GSK-3β制备及tau磷酸化活性研究

作者：刘振武; 王荷; 闫子迪; 张莹^*; 何金生

来源：中国生物工程杂志, 2023, 43(04): 10-19.

DOI：10.13523/j.cb.2211025

• 糖原合成激酶-3β
• 体外磷酸化
• 纤维聚集

目的：表达和纯化重组人糖原合成激酶-3β(glycogen synthetic kinase-3β,GSK-3β),优化反应条件，分析GSK-3β对tau蛋白磷酸化修饰产物p-tau的生物活性。方法：构建GSK-3β原核和杆状病毒表达载体，镍亲和层析纯化，BCA法测定蛋白浓度，考马斯亮蓝染色分析纯度；免疫印迹(Western blot)鉴定GSK-3β免疫反应性；液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)和斑点印迹检测GSK-3β的tau磷酸化情况；优化GSK-3β磷酸化体系中GSK-3β和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)的浓度；负染透射电镜(transmission electron microscopy, TEM)和硫磺素T(thioflavine-T,ThT)结合实验分析磷酸化产物形成纤维的情况；CCK8实验分析磷酸化产物的细胞毒性。结果：考马斯亮蓝染色显示，原核和杆状病毒表达的重组人GSK-3β蛋白表观分子量位于50 kDa左右，蛋白纯度分别为86%和81%;Western blot在相应位置有特异条带；LC-MS提示，经GSK-3β处理的tau蛋白有23个磷酸化位点；斑点印迹显示，兔抗pT181血清、兔抗pT217和pS404识别磷酸化的tau蛋白；优化反应条件，tau、GSK-3β和ATP的最适反应浓度分别为1μmol/L、5μmol/L和3.2 mmol/L;制备的GSK-3β对tau蛋白pT217位点磷酸化信号强于国外商品(P<0.05);TEM显示p-tau 5 d出现纤维结构，而tau未见明显的纤维结构；ThT结合实验检测到磷酸化产物的荧光值增强(P<0.05);磷酸化产物的细胞毒性增强(P<0.05)。结论：成功制备并鉴定了重组人GSK-3β,可催化tau蛋白在第181、217和404位氨基酸磷酸化，为阿尔茨海默病的基础研究提供了技术支撑。

• 单位
  北京交通大学