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摘要
目的：建立具有快速增殖能力的可逆永生化主动脉瓣膜间质细胞系。方法：体视显微镜下利用弹簧剪夹取瓣膜组织，胶原酶消化后加入逆转录永生化病毒，利用免疫荧光鉴定细胞是否属于间质细胞，显微镜观察细胞形态，结晶紫、CCK-8和流式细胞周期技术检测细胞增殖能力，碱性磷酸酶染色和茜素红钙盐沉积实验检测细胞成骨能力，q-PCR及Western blot检测细胞成骨标志物。结果：经光镜观察和免疫荧光鉴定，成功取到瓣膜间质细胞。加入永生化病毒后，经光镜观察和免疫荧光确认瓣膜间质细胞未发生表型改变，且在永生化的细胞中能够检测到大量SV40T(P<0.001)。结晶紫染色、CCK-8(P<0.001)和流式细胞周期结果提示永生化后的瓣膜间质细胞增殖速度变快。加入成骨诱导因子骨形态发生蛋白-9(bone morphogenetic protein9,BMP9)后永生化瓣膜间质细胞表现出较好的成骨能力，多数成骨标志物在分子层面的RNA和蛋白水平明显升高。去永生化后瓣膜间质细胞形态无明显改变，q-PCR结果显示SV40T明显降低（P<0.001），细胞增殖能力明显下降，且细胞周期被阻滞在G0/G1期。在BMP9诱导下去永生化瓣膜间质细胞同样具有成骨分化能力，且绝大多数成骨标志物都明显上升。结论：本研究成功建立可逆永生化瓣膜间质细胞系，BMP9可诱导其成骨分化，用于后续钙化性主动脉瓣膜疾病研究。
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