CDC25b突变载体的构建及其在小鼠受精卵中的表达

作者：任丽芳; 孟峻^*

来源：江苏医药, 2020, 46(08): 774-779.

DOI：10.19460/j.cnki.0253-3685.2020.08.005

• 真核表达载体
• 细胞分裂周期蛋白25b
• 细胞周期
• 小鼠

目的构建小鼠细胞分裂周期蛋白25b(CDC25b)突变基因的真核表达载体,并观察其在小鼠G2期受精卵细胞中的表达。方法采用PCR法从野生型CDC25b模版上扩增CDC25b(S15A)和CDC25b(S15D)突变基因,定向插入pcDNA3.1(+)-3flag-C空载体中,由限制性内切酶BamHⅠ和KpnⅠ进行双酶切电泳后测序验证,构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-3flag-CDC25b(S15A)和pcDNA3.1(+)-3flag-CDC25b(S15D)。采用脂质体法将其转染至Stbl3感受态细胞,质粒经在感受态细胞内转化、抽提、酶切及测序鉴定正确后,将重组真核表达质粒用显微注射法注射至小鼠G2期受精卵内,采用Western blot法检测重组质粒突变型CDC25b的表达。结果 pcDNA3.1(+)-3flag-CDC25b(S15A)和pcDNA3.1(+)-3flag-CDC25b(S15D)真核表达载体经酶切和测序鉴定,酶切结果显示与目的片段大小一致,测序结果显示突变序列正确;将其注射至小鼠G2期受精卵48 h,可检测到细胞内CDC25b蛋白表达增加(P<0.05)。结论成功构建CDC25b(S15A)和CDC25b(S15D)真核表达载体,验证了突变型CDC25b蛋白表达,可为CDC25b对小鼠受精卵发育调节的研究提供实验基础。

• 单位
  内蒙古医科大学附属医院