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摘要
目的 对分散泛菌的胞内脱乙酰酶(PantoeadispersaN-acetylglucosaminedeacetylase,Pd-nagA)进行表达条件优化及酶学性质分析。方法 本研究使用聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)技术对分散泛菌全基因组中Pd-nagA基因序列进行全长扩增,将含有Pd-nagA基因的质粒pET-28a(+)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,同时采用单因素实验,优化诱导温度、诱导前菌体生物量、诱导时间以及乳糖类似物异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)的浓度,采用Ni2+-次氮基三乙酸(nitrilotriacetic acid, NTA)进行重组酶的纯化,再对其酶学特性进行测定。结果 以pET-28a(+)质粒作为表达载体,大肠杆菌BL21(DE3)成功表达了可溶形式的Pd-nagA蛋白,分子量约为40kDa。当诱导温度为28℃,诱导前菌液OD600值为1.2, IPTG浓度为0.6 mmol/L,诱导时间为20 h时, Pd-nagA蛋白得到了大量表达。通过薄层层析法分析表明Pd-nagA重组蛋白能够在体外转化N-乙酰氨基葡萄糖生成氨基葡萄糖,Pd-nagA重组蛋白能够在高盐溶液中保持一半的相对酶活性,该酶4℃储存10d的相对活性仍然保持在90%以上,具有良好的储存稳定性,催化N-乙酰氨基葡萄糖生成氨基葡萄糖反应条件简单快捷。结论 本研究成功异源表达了具有催化活性的Pd-nagA酶,并对表达条件进行优化及酶学特性探究,可为工业上单酶催化制备氨基葡萄糖提供一定的理论参考。
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