一种高效的多点组合突变克隆构建方法（英文）

作者：王杰; 逯晓云; 刁爱坡; 江会锋^*

来源：生物工程学报, 2020, 36(02): 309-319.

DOI：10.13345/j.cjb.190147

• 组合突变
• 定向进化
• 高通量筛选
• 苯甲酰甲酸脱羧酶

高质量的突变方法和高效的筛选方法相结合可以提高酶定向进化的效率。文中开发了一种高效的多点组合突变(Multi-points combinatorial mutagenesis,MCM)的克隆方法。MCM方法通过引入DNA组装、融合PCR和杂交技术,实现高效多点组合突变。应用优化后的方法定向进化改造苯甲酰甲酸脱羧酶(Benzoylformate decarboxylase,BFD)来测试MCM方法的效率。通过电转至大肠杆菌感受态Escherichia coli TreliefTM 5α所获得的单菌落数量(Colony-formingunits,CFUs)超过106 CFUs/μgDNA。经验证90/100单菌落精确组装;5个位点L109、L110、H281、Q282和A460同时组合突变的效率达到88%。最后,筛选到一种kcat/Km提高10倍的突变酶(L109Y、L110D、H281G、Q282V和A460M)。因此,应用该方法可以有效地创建突变体库,促进酶的定向进化技术的快速发展。

• 单位
  中国科学院天津工业生物技术研究所; 天津科技大学; 生物工程学院