氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸对破骨细胞自噬和分化的影响

作者：陈苗苗; 仝锡帅; 郑嘉铭; 赵鸿雁; 顾建红; 刘宗平^*

来源：畜牧兽医学报, 2019, 50(11): 2339-2347.

• 破骨细胞
• 腺苷酸活化蛋白激酶
• 自噬

为了探究氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(AICAR)对破骨细胞自噬及分化能力的影响,以BALB/c小鼠骨髓巨噬细胞诱导分化形成的破骨细胞为研究对象,添加0.5 mmol·mL-1AICAR(AMPK激活剂)处理4 h后,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鉴定破骨细胞;CCK-8法检测破骨细胞存活率;高内涵系统分析TRAP+细胞比率、面积、荧光强度及圆度;蛋白免疫印迹(Western blot)和荧光定量聚合酶链式反应方法(qRT-PCR)检测AMPK、NFATc1、c-Fos、CTSK、TRAP、(LC3-Ⅱ)、ATG5、Beclin1、p62的mRNA和蛋白水平;激光共聚焦显微镜观察EGFP-pmCherry-LC3荧光聚点。结果显示,通过30 ng·mL-1M-CSF和60 ng·mL-1RANKL诱导分化4 d的细胞TRAP染色后大部分呈阳性且细胞核数目≥3。AICAR处理后,与对照组相比,细胞存活率无显著差异(P>0.05),但细胞面积、TRAP+(细胞核数目≥3)细胞率、TRAP荧光强度显著下降(P<0.05)。AICAR组破骨细胞c-Fos、TRAP(P<0.01)、p62(P<0.05)的mRNA水平显著下降,LC3、ATG5的mRNA水平显著升高(P<0.05)。AICAR处理致AMPKα蛋白磷酸化水平极显著升高(P<0.01),NFATc1、c-Fos、CTSK、p62(P<0.01)和TRAP(P<0.05)蛋白表达量显著下调,LC3-Ⅱ、ATG5和Beclin1蛋白表达水平极显著上调(P<0.01)。转染LC3质粒结果显示AICAR处理后LC3黄色及红色荧光聚点数目增多,绿色荧光聚点数目减少。结果表明0.5 mmol·mL-1AICAR作用4 h可激活破骨细胞AMPKα,增强破骨细胞的自噬水平,但抑制了破骨细胞的分化。

• 单位
  江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心; 扬州大学