布鲁氏菌分泌蛋白BspA和BspB真核表达载体的构建及在胚胎滋养层细胞中的表达

作者：王书利; 魏淑娟; 李梦含; 郑好; 司丽芳^*; 李志强^*

来源：河南农业科学, 2022, 51(08): 143-149.

DOI：10.15933/j.cnki.1004-3268.2022.08.017

• 布鲁氏菌
• BspA蛋白
• BspB蛋白
• 真核表达
• 胚胎滋养层细胞

为研究布鲁氏菌分泌蛋白BspA和BspB的作用，以布鲁氏菌S2308基因组为模板，根据GenBank登录的BspA和BspB基因序列设计引物，利用PCR扩增BspA和BspB基因片段，并将其克隆至pEGFP-N1载体，获得真核表达载体pEGFP-BspA和pEGFP-BspB。真核表达载体经酶切和测序分析鉴定后，利用LipofectamineTM2000脂质体转染至胚胎滋养层细胞(HPT-8)，采用Western blot(WB)检测BspA和BspB蛋白的表达，应用ELISA试剂盒检测细胞因子的分泌水平，利用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒检测细胞毒性水平。结果显示，BspA基因大小为576 bp,BspB基因大小为564 bp，真核表达质粒经限制性内切酶Eco RⅠ和XbaⅠ酶切验证正确，酶切产物经测序分析，显示与GenBank公布序列的同源性为100%;WB检测结果显示，pEGFP-BspA和pEGFP-BspB转染组分别在70 ku和68 ku处出现条带，与预期结果相符，表明BspA和BspB蛋白能在HPT-8细胞中表达；细胞因子检测结果显示，BspA和BspB蛋白可诱导HPT-8细胞分泌IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5；细胞毒性检测结果显示，BspA和BspB蛋白对细胞无毒性。综上，成功构建了真核表达载体pEGFP-BspA和pEGFP-BspB，证实其能在HPT-8细胞中表达，并能诱导细胞因子分泌。

• 单位
  商丘师范学院; 生命科学学院; 河南师范大学; 动物科技学院; 河南科技大学