贵州黑山羊COL1A1基因真核表达载体构建及其对颗粒细胞中胶原蛋白家族基因和产羔基因的影响

作者：周明帅; 温晓艳; 陆情梅; 刘彬; 杨永鲜; 赵佳福

来源：南方农业学报, 2022, 1-14.

• 贵州黑山羊
• COL1A1基因
• 细胞外基质
• 卵巢颗粒细胞
• 重叠延伸PCR
• 荧光定量PCR
• 产羔性状

【目的】为探究I型胶原蛋白α1链(Collagen type I alpha 1 chain，COL1A1)基因与贵州黑山羊(Capra hircus)产羔性状间的分子关系。【方法】通过重叠延伸PCR(Gene splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR)分别克隆COL1A1基因A、B两段，将其分别重组连接到pUC57和pcDNA3.1(+)线性化载体上，再将A和B片段酶切连接获得COL1A1基因全长，构建pcDNA3.1(+)-COL1A1真核表达载体。随后将表达载体转染至山羊卵巢颗粒细胞，通过Western blotting检测COL1A1的表达量，间接免疫荧光检测其在颗粒细胞中的定位，实时荧光定量PCR检测COL1A1基因过表达对胶原蛋白家族基因COL1A1、COL2A1和COL3A1及产羔相关基因骨形态发生蛋白15(BMP15)、骨形态发生蛋白受体1B(BMPR1B)、生长分化因子9(GDF9)和促卵泡激素β亚基(FSHB)表达的影响。【结果】Western blotting结果表明，转染pcDNA3.1(+)-COL1A1后，试验组COL1A1蛋白的表达量极显著高于转染pcDNA3.1(+)对照组(P<0.01，下同)；免疫荧光结果表明COL1A1蛋白在颗粒细胞细胞核及细胞质中均有表达，且该结果与软件预测结果一致；实时荧光定量PCR结果表明，试验组中胶原蛋白家族基因COL1A1、COL2A1和COL3A1及产羔基因GDF9、FSHB和BMPR1B的表达极显著高于对照组。【结论】成功构建COL1A1基因真核表达载体，且COL1A1的过表达能极显著促进胶原蛋白家族基因COL2A1和COL3A1及产羔基因GDF9、FSHB和BMPR1B在卵巢颗粒细胞的表达，推测COL1A1基因可协同胶原蛋白家族基因的表达促进细胞外基质(ECM)的合成来影响卵巢组织结构和胚胎发育及促进性腺激素的表达进而影响山羊产羔形状。