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摘要
目的构建携带增强绿色荧光蛋白基因的人PRKCB1真核表达载体并转染人脐静脉内皮细胞,鉴定所表达蛋白活性。方法从pMD18-T-PRKCB1质粒中,扩增出人PRKCB1并与带有增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pReceiver-M29酶切后连接、转化,所获重组体酶切鉴定及测序。按优化的转染参数,将pReceiver-M29-PRKCB1转染人脐静脉内皮细胞,观察荧光蛋白表达,随机视野下计数转染效率。测定激光共聚焦显微镜下胞膜与胞质的荧光强度比值,鉴定其活化转位。结果构建的真核表达质粒测序与GenBank公布的序列一致。转染后48 h,荧光蛋白表达最佳,转染率为18.6%±1.6%。从胞膜与胞质的荧光强度比值,观察到蛋白的活化转位。结论成功构建真核表达质粒并转染人脐静脉内皮细胞,观察到绿色荧光蛋白表达及蛋白的转位,为筛选稳定表达人蛋白激酶Cβ2的内皮细胞株,及其蛋白复合体分离提供分子工具。
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单位重庆医科大学附属第一医院
