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摘要
目的构建稳定表达乙型肝炎病毒(HBV)野生株和rtE218G阿德福韦酯耐药变异株的人细胞模型,评价HBV野生株和rtE218G变异株的体外药物敏感性。方法基于人肝细胞系HepG2,构建整合表达四环素调控元件(tTA)的工具细胞株;重组HBV野生株和rtE218G变异株HBV 1.2倍拷贝基因组至pTRE-Tight载体,与线性筛选标记物共转染tTA稳定表达细胞系,潮霉素筛选克隆,长期传代培养后,挑选受四环素严格调控表达的HBV高水平复制克隆,并对上述HBV野生株和变异株对阿德福韦酯的体外敏感性进行评价。结果克隆筛选获得tTA稳定表达的细胞株HepG2-off23,构建了HBV野生株和rtE218G变异株四环素调控表达质粒pTRE-HBV-WT(野生型)和pTRE-HBV-E218G(变异型),分别稳定转染HepG2-off23细胞后,成功筛选得到基于HepG2的野生型和变异型HBV高水平可调控表达细胞株HepG2-tetHBV-WT(HBV野生株)和HepG2-tetHBV-E218G(rtE218G变异株)。培养144h后,可检测到胞内HBV核心抗原(HBcAg)的高表达和病毒DNA复制中间体的高水平复制;且该细胞模型中的病毒复制可被培养体系中加入的四环素高效阻断,当四环素浓度为1 000 ng/ml时,Southern印迹检测不到复制中间体的存在。体外药物敏感性实验中,阿德福韦酯体外能够有效抑制HBV野生株的复制,半数抑制浓度(IC50)为(2.49±0.05)μmol/L,而rtE218G变异株表现出对阿德福韦酯的敏感性降低,其IC50为(6.49±0.09)μmol/L。结论构建了基于四环素调控表达的HBV野生株和rtE218G变异株稳定复制细胞模型。HepG2-off23工具细胞系结合pTRE-HBV载体,可以较为方便地构建HBV不同变异株的稳定细胞模型,为HBV病毒学研究和抗病毒药物筛选模型的建立提供有力支持。
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