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摘要
目的探讨TFP5(p35的一个裂解片段)特异性抑制细胞周期蛋白依赖蛋白激酶5(CDKS)/p25活力后在1-甲基-4-苯基吡啶(MPP)诱导的PC12细胞凋亡过程中的保护作用及其机制。方法使用100μg/Lβ神经生长因子将体外常规培养的PCI2细胞诱导分化为多巴胺能神经元,加入不同浓度MPP+(0、100、200、300、400、600、800、1000μmol/L)处理,应用CCK8法检测细胞活力,以明确MPP+诱导PC12细胞凋亡的合适浓度。将诱导分化后的PC12细胞分为4组:PBS+PBS组、MPP++PBS组、MPP++TFP5组和MPP++CDK5抑制剂Roscovitine组;TFP5与Roscovime提前12 h加入培养基中预处理(终浓度分别为100 nmol/L、10 nmo/L)。分别应用流式细胞仪及Hoechst33258染色检测细胞凋亡情况,应用Westernblotting检测细胞中p35/p25、半胱氨酸蛋白酶-3、裂解半胱氨酸蛋白酶-3蛋白表达水平。结果 CCK8法检测结果显示:MPP+浓度为300μmol/L时,PC12细胞的存活率为(64.84±1.58)%。流式细胞仪检测结果显示:MPP++PBS组细胞凋亡率[(25.61±2.74)%]最高,MPP++TFP5组细胞凋亡率[(13.33±1.24)%]较低,比较差异有统计学意义(P<0.05)。Hoechst33258染色结果显示:MPP++PBS组细胞核固缩及碎裂最明显,较多凋亡小体形成,而MPP++TFP5组与MPP++Roscovitine组仅有少量凋亡小体形成。Westernblotting检测结果显示:与PBS+PBS组比较,MPP++PBS组、MPP++TFP5组、MPP++Roscovitine组p25蛋白表达水平均明显增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。MPP++PBS组裂解半胱氨酸蛋白酶-3蛋白表达水平较PBS+PBS组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);MPP++TFP5组裂解半胱氨酸蛋白酶-3蛋白表达水平较MPP++PBS组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 TFP5通过特异性抑制CDK5/p25表达,减少裂解半胱氨酸蛋白酶-3蛋白的产生,对MPP+诱导的PC12细胞凋亡起抑制作用,从而对细胞产生保护作用。
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