Sortase A酶突变体的原核表达、纯化及活性测定（英文）

作者：张庆彬; 黄宗庆; 路建光; 赵文杰; 冯军^*

来源：中国医药工业杂志, 2020, 51(01): 37-47.

DOI：10.16522/j.cnki.cjph.2020.01.003

• 金黄色葡萄球菌
• 转肽酶A
• 酶学活性
• 纯化

本研究采用pET28a载体对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中的转肽酶A(sortase A,SrtA)截短体SrtA?N25以及突变体m5SrtA?N59、m9SrtA?N59进行了原核发酵表达,并通过镍柱亲和色谱、阳离子交换色谱进行蛋白纯化。随后,通过荧光共振能量转移试验比较了3种酶的催化活性,测定了酶反应动力学常数、筛选了最适反应条件,并进一步探究了不同生化试剂对SrtA酶学活性的影响。结果显示,SrtA?N25、m5SrtA?N59、m9SrtA?N59在大肠埃希菌中均能以可溶形式高效表达,且纯化后得到的高纯度SrtA酶均具有生物学活性。相较于SrtA?N25,m5SrtA?N59、m9SrtA?N59活性分别提高了约68、5 544倍,尤其是m9SrtA?N59的催化活性大大提高。m9SrtA?N59的最适反应温度为30～37℃,最适反应pH值为6.0～7.0,反应体系中加入三(2-羧乙基)膦(TCEP)、二硫苏糖醇(DTT)等还原剂有助于增强SrtA酶催化活性。

• 单位
  上海医药工业研究院; 创新药物与制药工艺国家重点实验室; 中国医药工业研究总院