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摘要
目的 为获得中华大蟾蜍甾醇-4α-羧酸酯-3-脱氢酶(NSDHL)以便于研究其功能，本文建立了该重组蛋白原核表达方法。方法 以中华大蟾蜍耳后腺总RNA为模板，采用RT-PCR技术克隆中华大蟾蜍NSDHL基因(Bbg-NSDHL)，对Bbg-NSDHL基因进行生物信息学分析，并以大肠埃希菌为宿主菌，采用p COLD-TF表达载体，构建Bbg-NSDHL原核表达系统，优化诱导表达条件。结果Bbg-NSDHLcDNA全长1521bp，开放阅读框长1038bp，编码345个氨基酸，所表达蛋白分子量为38.6 k D，理论等电点为8.70，分子式为C1756H2729N455O495S14。Bbg-NSDHL具有核苷二磷酸糖差向异构酶结构域和短链脱氢酶/还原酶超家族结构域，在270-292处存在1个明显的跨膜区。Bbg-NSDHL单体由5个α-螺旋和9个β-折叠组成。系统进化分析表明，Bbg-NSDHL与两栖动物的NSDHL聚为一类，与哺乳动物遗传距离较远。Rosetta菌株为Bbg-NSDHL重组蛋白表达适合宿主，最佳诱导条件为15℃条件下，细菌生长至OD600值为1.0时，加入0.1 mmol/L的IPTG诱导24 h。去除Bbg-NSDHL跨膜区截短表达可显著提升Bbg-NSDHL重组蛋白表达量。结论 本研究首次获得了中华大蟾蜍NSDHL c DNA全长序列，并建立了Bbg-NSDHL原核表达系统，为进一步研究该基因在中华大蟾蜍蟾毒配基类成分生物合成中的作用奠定了基础。
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单位中国航空工业集团公司洛阳电光设备研究所; 沈阳药科大学
