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摘要
本研究旨在构建Zbtb38(zinc finger and BTB domain containing 38)基因慢病毒过表达质粒载体。以小鼠脊髓组织为材料,采用重叠延伸PCR方法扩增小鼠Zbtb38基因的CDS序列,分别设计Zbtb38 CDS序列前段扩增引物1和后段扩增引物2,再以上述两对引物的扩增产物作为模板,设计引物3并进行融合PCR扩增,由此得到Zbtb38 CDS全序列。将获得的Zbtb38基因CDS全序列连接到质粒pGM-T,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,采用直接PCR鉴定阳性克隆并进行测序验证。利用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切方法将Zbtb38 CDS序列连接至慢病毒载体Plvx-puro,获得穿梭质粒Plvx-puro-Zbtb38,再与慢病毒包装质粒共转染293T细胞生产慢病毒颗粒。结果显示,引物1扩增产物包含Zbtb38 CDS全序列的第1-1 794 bp,扩增产物实际测序长度为1 772 bp,引物2扩增产物包含Zbtb38 CDS全序列的第1 762-3 594 bp,扩增产物实际测序长度为1 818 bp,说明分段扩增目的片段已成功。引物3扩增的预期融合产物及菌落PCR扩增产物均包含Zbtb38 CDS全序列(3 594 bp),与NCBI数据库Zbtb38基因的CDS序列比对后的重合率达99.99%,表明Zbtb38 CDS序列扩增成功。实时荧光定量PCR检测结果显示,病毒滴度达3.25×108 Tu/mL,达到普通动物注射标准要求,提示慢病毒载体构建成功。综上所述,本试验成功构建了小鼠Zbtb38基因慢病毒过表达质粒载体。
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