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摘要
目的探究组织蛋白酶D(CatD)对皮肤成纤维细胞降解吞入胞内的晚期糖基化终末产物(AGE)的调控作用。方法分别以CatB+CatL、CatD以及20S蛋白酶体的酶活性抑制剂CA074Me、天冬氨酸酶抑制剂(pepstatin A)、MG-132处理皮肤成纤维细胞, CCK8和荧光法检测细胞活性及蛋白酶活性。CA074Me、pepstatin A、MG-132组分别加入AGE-BSA孵育8 h, 而对照组加入磷酸盐缓冲液(PBS)。孵育8 h后, 置换含相应抑制剂的新鲜培养基继续培养24 h, 流式细胞仪检测各时间点胞内AGE-BSA平均荧光强度。以不同浓度pepstatin A(37.5、75、150 μmol/L)或PBS处理皮肤成纤维细胞, 加入AGE-BSA孵育, 方法同前, ELISA检测各时间点胞内AGE-BSA平均浓度, 计算降解率。慢病毒转染皮肤成纤维细胞, 设空白对照组、空载病毒转染组、CatD高表达慢病毒转染组, 荧光显微镜观察, RT-PCR、Western印迹法和荧光法检测各组CatD mRNA和蛋白表达及酶活性。分别加入AGE-BSA孵育, 处理及检测方法同前, 计算降解率。结果 1 μmol/L CA074Me组、75 μmol/L pepstatin A组及1 μmol/L MG-132组细胞增殖活性均在90%以上, 与对照组(100%)差异无统计学意义(F=1.525, P > 0.05)。去除AGE-BSA 24 h后, CA074Me+AGE-BSA组和MG-132+AGE-BSA组胞内AGE-BSA荧光强度(275.00 ± 10.15、259.00 ± 11.14)均较其相应8 h点荧光强度(295.00 ± 6.56、285.67 ± 8.74)显著下降(配对t值分别为4.778、6.154, 均P < 0.05), 而pepstatin A+AGE-BSA组8 h和32 h点细胞内AGE-BSA荧光强度差异无统计学意义(均P > 0.05)。37.5、75和150 μmol/L pepstatin A组24 h内对吞入胞内AGE-BSA的降解率分别为9.64% ± 1.27%、5.62% ± 0.47%和3.21% ± 0.73%, 各组间差异有统计学意义(F=45.876, P < 0.05), 且该降解率随pepstatin A浓度增加而降低(P < 0.05)。荧光显微镜下观察, 空白对照组细胞未见荧光, 空载病毒转染组和CatD高表达慢病毒转染组细胞荧光阳性率均在80%以上。CatD高表达慢病毒转染组CatD mRNA、蛋白表达及活性均较另2组显著上调(均P < 0.05)。CatD高表达慢病毒转染+AGE-BSA组24 h内AGE-BSA的降解率显著高于AGE-BSA组和空载病毒转染+AGE-BSA组(均P < 0.05)。结论 CatD可促进皮肤成纤维细胞降解吞入胞内的AGE-BSA。
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