腺相关病毒介导shRNA敲减小鼠海马兴奋性氨基酸转运体3动物模型的构建

作者：侯爱生; 王晓燕; 武屹爽; 曹福羊; 刘蔷薇; 张璇; 沈浩; 曹江北^*

来源：解放军医学院学报, 2019, 40(05): 473-481.

• 腺相关病毒
• 兴奋性氨基酸转运体3
• 短发卡RNA
• 小鼠
• 海马

目的构建敲减小鼠海马神经元兴奋性氨基酸转运体3(excitatory amino acid transporter 3,EAAT3)重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体,建立一种小鼠海马EAAT3敲减动物模型。方法基于SLC1A1(solute carrier family 1 member 1)基因mRNA序列设计4条shRNA(short hairpin RNA),将其模板DNA与酶切后的AAV-GP-1(pAAV-U6-EGFP)载体质粒连接、转化并测序鉴定得到重组质粒,将重组质粒、pHelper包装质粒和pAAV-DJ辅助质粒共同转染至AAV-293细胞包装得到rAAV;用所得rAAV侵染HT-22细胞,72 h后RT-qPCR检测SLC1A1 mRNA表达水平;36只成年C57小鼠随机分为6组,每组6只,予海马注射rAAV-shRNA-SLC1A1-2-EGFP病毒液1μL/侧,分别于注射后即刻、24 h、7 d、14 d、21 d、28 d取双侧海马组织,Western blot检测EAAT3表达水平。结果经测序重组质粒核苷酸序列正确,包装所得病毒浓缩滴度为1×1013 TU/ml;rAAV感染HT-22细胞72 h后SLC1A1表达量明显降低且显著低于阴性对照(P <0.01,n=3);小鼠海马注射rAAV-shRNA-SLC1A1-2-EGFP 7 d后EAAT3相对表达量下降(P <0.01),注射后21 d、28 d表达进一步降低(P <0.01)。结论成功构建介导shRNA表达的重组腺相关病毒系统,建立了一种有效的小鼠海马EAAT3敲减动物模型。

• 单位
  解放军总医院