利用CRISPR/Cas9系统靶向敲除猪肠上皮细胞(IPEC-J2)ace2基因及其功能分析

作者：王凯; 王换换; 刘颖; 纪晓霞; 张源淑^*

来源：农业生物技术学报, 2019, 27(04): 656-665.

• 血管紧张素转移酶2基因(ace2)
• CRISPR/Cas 9
• 猪肠上皮细胞(IPEC-J2)

关于血管紧张素转移酶2 (angiotensin converting enzyme 2, ACE2)的研究目前主要集中于啮齿类动物和人类(Homo sapiens),猪(Sus scrofa domesticus)方面的资料较少。ACE2在不同组织器官中良好的抗炎、抗损伤作用已被广泛认可,但在肠道中的作用尚不明确。本研究拟利用CRISPR/Cas9基因编辑技术建立猪肠上皮细胞(porcine intestinal epithelial cell, IPEC-J2) ace2基因敲除方法,探究ace2缺失对细胞炎性损伤的影响。首先通过Western blot和免疫荧光染色方法证实所选取的IPEC-J2细胞有ACE2蛋白表达;然后以猪ace2基因为敲除靶点,设计合成3对单导向RNA (single guide RNA, sgRNA),并插入含有Cas9骨架的pX330质粒,构建ace2基因打靶载体pX330-ace2-1、pX330-ace2-2和pX330-ace2-3。将测序正确的重组质粒pX330-ace2-2转染至IPEC-J2细胞,Western blot和免疫荧光染色结果显示ACE2蛋白表达缺失;以酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)方法检测ace2敲除细胞的炎性因子水平,结果显示,脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)处理组的促炎因子白介素(interleukin, IL)-1β和IL-8显著升高(P<0.01)、抗炎因子IL-10显著降低(P<0.05),细胞炎性损伤加剧,提示肠道ACE2具有一定的抗炎作用。本研究利用CRISPR/Cas9系统建立了靶向敲除猪肠上皮细胞ace2基因的方法,并初步探讨了ACE2在猪肠道的抗炎作用,为深入开展ACE2相关功能和作用机制研究提供了基础资料。

• 单位
  农业部; 南京农业大学