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摘要
目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)/内皮祖细胞(EPC)作为种子细胞构建的基质依赖型组织工程骨(ECM-TEB)修复大鼠股骨缺损的效果。方法分离培养骨髓来源的MSC和EPC并进行功能鉴定, 种植上架于纳米晶胶原基人工骨颗粒, 培养14 d后冻干, 获得MSC/EPC ECM-TEB和MSC ECM-TEB。扫描电镜观察MSC和EPC在支架表面的生长形态。分别提取MSC ECM-TEB蛋白浸提液(对照组)和MSC/EPC ECM-TEB蛋白浸提液(实验组), 加入EPC培养系统中进行迁移、划痕修复、管腔形成检测;另加入MSC培养系统中进行茜素红染色和碱性磷酸酶(ALP)染色检测, 观察两组细胞募集、血管生成和成骨分化情况。选取12只SD大鼠, 建立股骨缺损模型, 按照随机数字表法分为:(1)假手术组:仅在缺损处进行清创处理;(2)MSC ECM-TEB组:在缺损处植入MSC ECM-TEB;(3)MSC/EPC ECM-TEB组:在缺损处植入MSC/EPC ECM-TEB, 每组4只大鼠。2个月后行Micro-CT检查和缺损区Masson三色染色观察骨缺损修复情况。冻干后低温保存3个月, 采取同位素相对标记与绝对定量技术(iTRAQ)标记蛋白质谱检测MSC ECM-TEB和MSC/EPC ECM-TEB在成血管方面的差异, 并采用基因本体论/京都基因与基因组百科全书技术(GO/KEGG)功能富集方法分析其原因。结果 MSC和EPC在支架表面生长、增殖良好, 形成光滑的细胞层状结构。实验组在细胞迁移数、划痕修复比例和管腔形成长度分别为(121.6±8.3)个、(61.5±5.9)%、(11.3±0.6)mm, 较对照组显著增多[(85.0±6.7)个、(39.3±3.6)%、(5.9±0.4)mm](P均<0.01)。茜素红染色和ALP染色结果显示, 实验组钙结节矿化面积比例显著增加[(38.8±3.3)%∶(49.9±3.0)%、(38.8±2.4)%∶(45.3±3.3)%] (P均<0.05)。Micro-CT和Masson染色结果表明, MSC/EPC ECM-TEB组骨缺损修复良好, MSC ECM-TEB组仅形成少量新骨, 假手术组几乎没有新骨形成;骨体积分数、骨小梁数量和骨小梁厚度差异均有统计学意义(P<0.05)。蛋白质谱分析结果表明, 与MSC ECM-TEB组相比, MSC/EPC ECM-TEB组中有83个血管生成相关的因子显著上调(差异倍数>2, P<0.05);GO/KEGG功能富集分析显示, 与MSC ECM-TEB相比, MSC/EPC ECM-TEB在"血管发育"等生物过程存在明显差异(P<0.01), "血管平滑肌收缩通路"等显著增强(P<0.01)。结论与MSC ECM-TEB相比, MSC/EPC ECM-TEB在细胞募集、血管生成和新骨生成方面显著增强, 是一种更佳的可用于创伤性骨缺损修复的组织工程骨构建策略。
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单位第一附属医院骨科; 中国人民解放军陆军军医大学
