单启动子双表达载体pIRES-p14ARF-p53的构建及其对骨肉瘤细胞增殖的抑制作用

作者：李进; 杨述华; 邹利军; 邵增务; 廖翔

来源：中华实验外科杂志, 2007, 24(04): 473-476.

DOI：10.3760/j.issn:1001-9030.2007.04.031

• 骨肉瘤
• 启动子
• 脱噬作用
• 基因治疗

目的构建双质粒表达载体pIRES-p14ARF-p53,并研究其对骨肉瘤细胞增殖生长的抑制作用。方法利用基因工程技术,将从培养的正常人肝细胞系L02细胞中扩增出的p14cDNA (0.5 kb)亚克隆至pIRES载体中,通过聚合酶链反应(PCR)、限制性内切酶酶切鉴定重组质粒pIRES-p14ARF-p53。通过脂质体介导转染入骨肉瘤MG-63细胞中,并筛选出阳性克隆,流式细胞仪测定瘤细胞DNA含量和细胞周期;逆转录(RT)-PCR和Western bolt对稳定转染后的瘤细胞p53、p14ARF蛋白的表达进行定性和半定量检测。噻唑蓝(MTT)比色法与细胞生长曲线观察细胞增殖情况。结果成功构建出双质粒表达载体plRES-p14ARF-p53。转染后瘤细胞形态由转染前密集排列的多角形、星形转变为排列稀疏的长梭形细胞,瘤细胞生长速度较前缓慢,群体倍增时间比转染前增加了2.3倍,且易出现脱壁并见散在瘤细胞凋亡;流式细胞仪检测发现转染后的瘤细胞多停滞于G,期;RT-PCR与Western blot检测证实p14ARF、p53基因在靶细胞mRNA和蛋白水平分别有独立表达,转染MG-63后24、48、72、96 h瘤细胞生长抑制率分别为:33.43%、69.37%、66.19%、75.26%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论μ野生型p53和p14ARF协同抑制骨肉瘤细胞的增殖促进瘤细胞的凋亡,为进一步研究p14ARF与p53在骨肉瘤基因治疗的体内实验奠定了基础。

• 单位
  协和医院; 同济医院; 华中科技大学