稳定低表达GSNOR细胞系Neuro-2a的构建及其对S-亚硝基化的影响

作者：严洁萍^*; 韩臻平; 李婷婷; 王思懿; 高立; 罗双; 李汉兵; 黄萍

来源：中国病理生理杂志, 2022, 38(09): 1547-1552.

• S-亚硝基谷胱甘肽还原酶
• 慢病毒
• Neuro-2a细胞
• S-亚硝基化

目的：探讨转染慢病毒载体构建稳定低表达S-亚硝基谷胱甘肽还原酶(S-nitrosoglutathione reductase,GSNOR)的小鼠神经母细胞瘤Neuro-2a细胞系，并考察稳定低表达GSNOR对S-亚硝基化修饰水平的影响。方法：构建靶向GSNOR的慢病毒载体，用LipoFiterTM脂质体转染Neuro-2a细胞，并用嘌呤霉素筛选稳定低表达GSNOR的细胞系。光镜观察Neuro-2a细胞的形态变化，CCK-8法检测转染不同时间后的细胞活力，RT-qPCR和Western blot检测GSNOR的mRNA和蛋白表达水平。生物素转换法检测转染后Neuro-2a细胞内总S-亚硝基化蛋白水平。结果：HBLV-m-ADH5-shRNA1-PURO慢病毒载体序列与目的序列结果一致，提示慢病毒载体构建成功。嘌呤霉素筛选后，光镜观察Neuro-2a细胞形态良好，CCK-8实验结果显示在24、48、72和96 h时点细胞活力无显著差异，提示转染对细胞活力无明显影响。转染第2、4和6代后细胞内GSNOR mRNA水平分别是空载病毒组的37.02%、40.66%和30.13%，均显著降低(P<0.01),GSNOR蛋白表达水平较空载病毒组亦显著下降(P<0.01)。此外，稳定低表达GSNOR的Neuro-2a细胞中蛋白S-亚硝基化修饰水平显著上调(P<0.01)。结论：稳定低表达GSNOR的Neuro-2a细胞系构建成功，GSNOR低表达可上调胞内总蛋白的S-亚硝基化修饰水平。

• 单位
  浙江工业大学; 杭州医学院; 浙江省人民医院