六种水稻病毒一步法多重RT-PCR快速检测方法的建立

作者：黄静; 王晨一; 兰彬源; 丁新伦; 张帅; 吴建国^*

来源：农业生物技术学报, 2022, 30(04): 619-627.

• 水稻病毒
• 多重RT-PCR
• 病毒检测

农业生产上水稻(Oryza sativa)病毒病的发生大多为复合侵染，仅通过病毒病症状学的诊断往往很难准确分辨，因此开发快速精准诊断多种水稻病毒病的检测技术，对于水稻病毒病害的精准测报具有重要应用价值。基于此，本研究根据当前我国南方农业生产上常见的6种水稻病毒，即水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)、水稻草状矮化病毒(Rice grassy stunt virus, RGSV)、水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus,RDV)、水稻锯齿叶矮缩病毒(Rice ragged stunt virus, RRSV)、水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)的外壳蛋白(coat protein, CP)的基因序列，设计了特异性检测引物，建立了可同时检测6种病毒的一步法多重逆转录PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR)体系，其结果表明一步法多重RT-PCR检测反应体系(总体系20μL)中，RSV上下游引物浓度为10μmol/L的体积加量为0.6μL、RDV为0.4μL、RGSV为0.3μL、RRSV为0.4μL、RBSDV为0.6μL、SRBSDV为0.2μL;Onestep RT/Taq Mix的用量确认为0.75μL,5×反应缓冲液用量为4μL，模板量为1μg。多重RT-PCR参数设定为RNA反转录50℃30 min；预变性94℃2 min;94℃变性30 s；退火温度58℃，30 s;72℃延伸1 min,35个循环；72℃终延伸10 min。研究结果表明该体系可同时高效精准地检测6种水稻病毒，极大地提高了检测效率；该方法可广泛应用于实验室精准检测、田间水稻病毒病和传毒介体的检测，也为相关产品的研发提供技术支持和参考依据。

• 单位
  福建农林大学; 漳州职业技术学院