ADP-核糖基化因子抑制剂在实验性碱烧伤诱导角膜新生血管中的作用及其机制

作者：刘高勤; 吴敬; 陈志刚; 肖艳辉; 陆培荣

来源：中华实验眼科杂志, 2014, 32(02): 101-106.

DOI：10.3760/cma.j.issn.2095-0160.2014.02.002

• 角膜
• 新生血管
• ADP-核糖基化因子
• 碱烧伤
• 血管内皮生长因子
• 血管内皮细胞

背景角膜新生血管(CNV)是导致角膜盲的主要原因之一,研究表明,ADP-核糖基化因子(ARF)对肿瘤细胞的增生有调节作用,抑制ARF能抑制血管的形成,但ARF抑制剂对CNV是否发挥作用尚不清楚。目的探讨ARF抑制剂在碱烧伤诱导的CNV形成过程中的作用及其机制。方法 78周龄清洁级雄性BABL/c小鼠60只按照随机数字表法分为PBS对照组和ARF抑制剂干预组,每组各30只。所有小鼠采用角膜碱烧伤诱导法构建CNV模型,ARF抑制剂干预组小鼠于造模后1周腹腔内注射0.5g/L ARF抑制剂溶液0.5 ml,每周3次,共1周,PBS对照组小鼠以同样方式注射0.5 ml PBS。各组分别取24只小鼠,于造模后0、4、7、14 d采用实时定量PCR(real—timePCR)和Western blot法检测小鼠角膜组织中ARF mRNA和蛋白的动态表达,并于造模后14 d,采用Western blot法检测各组小鼠角膜组织中血管内皮生长因子(VEGF)的表达。各组另取6只小鼠,于造模后2、4、7、14 d裂隙灯显微镜下观察CNV形成情况,并于造模后14 d,采用全视网膜铺片免疫荧光组织化学法检测角膜组织中CD31在CNV中的表达。体外实验中应用ARF抑制剂干预人视网膜血管内皮细胞(RECs),CCK8法和细胞划痕法检测ARF对人RECs增生和迁移的影响。实验动物的使用和喂养遵循视觉及眼科学研究协会有关规定及苏州大学《实验动物管理及使用指南》。结果造模后PBS对照组和ARF抑制剂干预组小鼠角膜组织中ARF mRNA在各个时间点均有表达,在造模后14 d达高峰,各组小鼠角膜中ARF mRNA的表达随着时间的延长而增加,差异有统计学意义(F时间=65.17,P=0.00),不同时间点的组间比较差异无统计学意义(F分组=1.98,P=0.18);造模后14 d,ARF抑制剂干预组实验后不同时间点ARF蛋白水平相对表达值比较差异有统计学意义(F=10.77,P=0.00)。裂隙灯显微镜下检查发现,ARF抑制剂干预组CNV相对面积为0.45±0.05,PBS对照组为0.72±0.11,2个组间差异有统计学意义(t=-3.87,P<0.05)。全角膜铺片免疫荧光组织化学法检测表明,ARF抑制剂干预组小鼠角膜组织CD31表达面积明显小于PBS对照组。造模后14 d,Western blot法检测显示,ARF抑制剂干预组VEGF蛋白表达水平为1.20±0.21,明显低于PBS对照组的2.47±0.33,差异有统计学意义(t=-5.62,P<0.05)。CCK8法检测结果显示,随着ARF抑制剂质量浓度的增加,ARF抑制剂对人RECs的抑制率增加,差异有统计学意义(F=8.47,P=0.02)。细胞划痕实验后24 h,100μg/L和1 000μg/L ARF抑制剂干预组人RECs迁移距离分别为(5.46±1.32)μm和(5.04±1.68)μm,与PBS对照组的(8.49±1.18)μm相比明显减小,差异均有统计学意义(t=-2.94、-2.91,P<0.05)。结论 ARF抑制剂能抑制碱烧伤诱导的CNV发生,可能与其下调VEGF的表达以及抑制血管内皮细胞的增生和迁移有关。

• 单位
  苏州大学附属第一医院