猪流行性腹泻病毒微滴式数字PCR定量检测方法的建立及初步应用

作者：周建浩; 王东方; 刘影; 王淑娟; 马震原; 谢彩华; 赵雪丽; 杨海波; 冯桂丹; 康台生; 胡煜锋; 李博文; 闫若潜^*

来源：畜牧兽医学报, 2023, 1-10.

• 猪流行性腹泻病毒
• 微滴式
• 数字PCR
• 方法
• 建立

旨在建立一种敏感性高、特异性强、重复性好的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)微滴式数字PCR(Droplet Digital PCR， ddPCR)定量检测方法。本研究根据GenBank登录的PEDV(MK862249.1)M基因序列保守区设计合成特异性引物对和探针；通过对反应体系和反应条件的优化，成功建立了可用于检测PEDV的荧光定量PCR(fluorescent quantitative real-time PCR ，FQ-PCR)方法，将自行建立的FQ-PCR方法的引物对/探针用来确定ddPCR 方法；对ddPCR方法进行了敏感性、特异性、重复性和初步应用试验。结果显示：自行建立的FQ-PCR方法在敏感性、重复性等方面均优于行标FQ-PCR方法；根据自行设计的FQ-PCR方法建立的ddPCR方法最低检测极限为0.15 copies·μL -1，敏感性高于行标FQ-PCR(1.0×101 copies·μL -1)；模板浓度为1.0×100 copies·μL -1～1.0×104 copies·μL -1时，具有良好的线性关系(R2>0.99)；批内、批间变异系数(CV%)为1.52%～7.40%；对猪丁型冠状病毒、猪伪狂犬病毒等11种对照病毒核酸检测结果均为阴性；分别用建立的ddPCR方法、行标FQ-PCR方法对150份临床样品进行PEDV核酸检测，ddPCR方法对行标FQ-PCR方法检测阳性样品的检测符合率为100%。本研究成功建立的PEDV ddPCR检测方法可用于临床上PEDV感染的早期检测和定量检测，为PEDV核酸标准物质的研制提供了定量手段。

• 单位
  河南省动物疫病预防控制中心; 动物科技学院; 河南科技大学; 河南农业大学; 上海市动物疫病预防控制中心