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摘要
目的 构建大片段基因克隆用高拷贝BAC质粒载体以用于CYP2A6基因的单倍型分析。方法 利用退火程序生成包含多克隆位点的寡核苷酸，分别连接入HindⅢ/BamHⅠ双酶切后的pGEM-3Z载体及pBeloBAC11载体，随后使用HindIII单酶切中间载体并连接，利用蓝白斑筛选获得头尾串联的高拷贝BAC载体pBAC-BJH。利用STIPCR的方法扩增CYP2A6基因全长，经切胶纯化后利用BstBI与MluI双酶切，并与同样双酶切的pBAC-BJH载体连接，转化大肠杆菌以获得包含新突变355A>T的全长Bac克隆用于单倍型测序分析。结果 成功构建了增加7个多克隆酶切位点的高拷贝BAC载体pBAC-BJH。该载体具有拷贝数高、可选酶切位点多等优势。利用该载体对CYP2A6的基因分型结果显示，新突变体携带22C>T，51A>G，355A>T，3个SNP单倍型为CGT。结论 成功构建了方便用于大片段基因克隆的载体pBAC-BJH，该载体可用于P450基因的单倍型分析及其他大片段基因克隆分析。
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单位中国医学科学院; 北京大学
