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摘要
目的 探讨汉防己乙素衍生物LYY-47对三阴性乳腺癌(TNBC)细胞及其多倍体巨瘤细胞(PGCCs)增殖、凋亡的作用和机制。方法 取TNBC MDA-MB-231细胞和MDA-MB-436细胞培养至对数生长期，诱导形成PGCCs,培养35 d,采用苏木素-伊红(H&E)染色观察不同培养时间时2种细胞的PGCCs形态学特征并进行计数；收集MDA-MB-231细胞、PGCCs及其子代细胞，采用流式细胞仪检测分析细胞周期，采用Western blot检测周期相关蛋白[细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)和细胞周期蛋白B1(CyclinB1)]、干性相关蛋白[乙醛脱氢酶1A1(ALDH1A1)、白细胞分化抗原44(CD44)及白细胞分化抗原133(CD133)]、DNA损伤修复相关蛋白[布卢姆(BLM)、Rad51及乳腺癌易感基因1(BRCA1)]及凋亡相关蛋白[BCL2-相关X蛋白(Bax)、B淋巴细胞瘤蛋白-2(Bcl-2)、裂解凋亡蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)及裂解凋亡蛋白酶-8(cleaved Caspase-8)]的表达，采用噻唑蓝(MTT)法和克隆形成实验检测细胞活力和细胞集落数，采用细胞免疫荧光实验检测磷酸化组蛋白2AX(γ-H2AX)的表达；采用荧光偏振实验检测BLM DNA解旋酶的活性；收集对数生长期MDA-MB-231细胞，分为对照组(同等体积的完全培养基)、紫杉醇(PTX)组(500 nmol/L PTX)、3-CF3, 4-F-苯基类似物(ML216)组(3μmol/L ML216)及ML216+PTX组(500 nmol/L PTX和3μmol/L ML216),采用Image J软件计数各组细胞数；收集对数生长期MDA-MB-231细胞及其PGCCs子代细胞，分为对照组(0.00μmol/L)、LYY-47给药组(2.50μmol/L、5.00μmol/L及6.50μmol/L),采用流式细胞仪检测上述各组细胞的凋亡情况；6周龄雌性无特定病原体(SPF)级无胸腺BALB/c裸鼠12只，皮下分别注射5×106个MDA-MB-231细胞及其PGCCs子代细胞，每隔3天测量1次肿瘤体积，连续29 d,处死裸鼠剥离肿瘤、称重，取肿瘤组织制作切片，采用H&E染色和免疫组织化学染色观察细胞形态和检测BLM、Ki-67的表达。结果 与TNBC MDA-MB-231和MDA-MB-436细胞相比，PTX诱导的PGCCs出现增大的细胞核和细胞质区域，通过不对称分裂产生子代细胞；与MDA-MB-231细胞相比，PGCCs中S期和G2/M期细胞增加、CDK1和CyclinB1蛋白表达下调(P<0.05或P<0.01),其子代细胞中S期细胞增加、G2/M期细胞减少且CDK1、CyclinB1蛋白表达上调(P<0.05或P<0.01),PGCCs及其子代细胞中ALDH1A1、CD44及CD133蛋白表达上调(P<0.05),PGCCs子代细胞的增殖和克隆形成能力增强(P<0.05),γ-H2AX、 BLM、BRCA1及Rad51蛋白表达上调(P<0.05);与PTX组相比，ML216+PTX组PGCCs形成的数量明显减少(P<0.01);PGCCs子代细胞体内成瘤的生长速度、肿瘤的体积和重量均大于MDA-MB-231细胞(P<0.01),瘤体中BLM与Ki-67均呈高表达(P<0.01);与对照组相比，LYY-47给药组BLM642-1290DNA解旋酶的ATPase、dsDNA解链活性以及DNA结合活性均下调(P<0.05), MDA-MB-231细胞及其PGCCs子代细胞中BLM、Rad51及BRCA1蛋白表达也均下调(P<0.05);与对照组相比，LYY-47给药组和ML216给药组MDA-MB-231及其PGCCs子代细胞增殖和克隆形成能力降低(P<0.05),LYY-47给药组能够引起MDA-MB-231及其PGCCs子代细胞G2/M期细胞增加(P<0.05)、S期细胞减少(P<0.05)、细胞内周期相关蛋白CDK1与CyclinB1的表达下调(P<0.05),ML216给药组MDA-MB-231及其PGCCs子代细胞G1期细胞增多、S期细胞减少(P<0.05);与对照组比较，LYY-47给药组MDA-MB-231细胞及其PGCCs子代细胞的总凋亡比例增加、Bcl-2表达下调及Bax、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-8蛋白表达上调(P<0.05)。结论 LYY-47和ML216可影响TNBC及其PGCCs子代细胞的增殖，其机制可能与抑制BLM DNA解旋酶诱导细胞凋亡和阻滞细胞周期有关。
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