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摘要
目的 构建和鉴定慢病毒介导的小鼠线粒体靶向8-羟基脱氧鸟嘌呤DNA糖苷酶1(mito-OGG1)基因在661W细胞中的过表达,以及慢病毒介导的短发夹RNA(shRNA)下调OGG1基因在661W细胞中的表达。方法 构建目的质粒pLenti-EF1a-EGFP-P2A-Puro-CMV-Mito-OGG1-3Flag(pLenti-OGG1-GFP)和pLKD-CMV-G&PR-U6-shRNA(pLKD-shRNA),利用第2代慢病毒包装系统和293T细胞获得绿色荧光蛋白(GFP)标记的目的慢病毒载体,利用293T细胞进行病毒滴度检测,荧光显微镜计数法检测不同感染复数(MOI)梯度下661W细胞的转染效率和生存情况,并确定最适MOI,利用不同浓度梯度嘌呤霉素作用于661W细胞以筛选出嘌呤霉素最低使用浓度,并以此浓度筛选出稳定转染细胞株,免疫荧光检测筛选后细胞转染效率并进行细胞色素C氧化酶Ⅳ(COXⅣ)-OGG1共定位鉴定,采用荧光定量PCR(QPCR)和Western blot法分别检测OGG1基因的mRNA和蛋白相对表达水平。结果 测序结果显示,过表达质粒中插入的序列与基因库中小鼠OGG1(NM010957.4)基因序列一致,包装纯化后的慢病毒原液滴度为2.0×107～6.0×107 TU/ml,661W细胞最适MOI为40,4.0 μg/ml嘌呤霉素成功筛选出稳转株,筛选后转染效率达100%。免疫荧光染色结果显示,OGG1与COXⅣ成功共定位。空白对照组、OGG1组、过表达对照组、shRNA组和低表达对照组OGG1 mRNA相对表达量分别为1.000±0.000、41.581±12.206、0.888±0.056、0.239±0.121和1.081±0.083,OGG1蛋白的相对表达量分别为1.029±0.153、1.657±0.237、0.752±0.143、0.471±0.149和1.036±0.185,各组间总体比较差异均有统计学意义(F＝44.654、30.948,均P<0.05),其中OGG1组的OGG1 mRNA和蛋白相对表达量均较过表达对照组明显升高,shRNA组的OGG1 mRNA和蛋白相对表达水平均较低表达对照组明显降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论 本实验成功构建661W细胞mito-OGG1过表达和OGG1敲减模型,为下一步研究提供了实验基础。
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