绵羊肺炎支原体对肺上皮细胞自噬影响的研究

作者：罗海霞; 孙远航; 徐兆坤; 冯婷婷; 郝秀静; 李敏^*

来源：中国预防兽医学报, 2020, 42(12): 1268-1274.

• 绵羊肺炎支原体
• 自噬
• TC-1细胞

自噬是一种广泛存在于真核细胞中的生理现象,在维持细胞稳态及抗感染免疫过程中发挥着重要作用。但是,绵羊肺炎支原体(MO)与细胞自噬的关系尚不明确。为研究MO感染宿主呼吸道上皮细胞后是否发生细胞自噬,本实验以小鼠肺脏上皮细胞TC-1为研究对象,经RT-PCR检测MO(MOI10)感染TC-1细胞后不同时间自噬相关基因的转录水平。结果显示,与感染前相比自噬相关基因LC3I、LC3II、P62及Atg7的转录水平均显著上升(p<0.05),并且在感染6 h转录水平最高(分别上升1.8倍、1.5倍、1.6倍和2.3倍);Western blot检测MO感染TC-1细胞后不同时间自噬相关蛋白的表达。结果显示,与感染前相比,LC3II、P62及Atg7的蛋白表达水平均显著上升(p<0.05),并且在感染12 h蛋白表达量最高(分别上升2.4倍、5.8倍、3.1倍)。以上结果从转录水平和蛋白水平均表明MO能引起TC-1细胞的自噬。利用腺病毒mRFP-GFP-LC3转染TC-1细胞24 h后感染MO,6 h、12 h、24 h后分别经荧光显微镜观察细胞内绿色和红色斑点的变化,监测MO诱导的细胞自噬流。结果显示,与未感染组相比,MO感染TC-1细胞内有更多的黄色(红色和绿色斑点叠加,表示自噬体)和红色斑点(p<0.05),并且随着感染时间的延长红色斑点增多,表明MO可诱导TC-1细胞形成完整的自噬流。通过siRNA技术沉默TC-1细胞中P62和Atg7基因的表达,利用western blot检测该两个基因沉默后细胞中LC3II蛋白的表达。结果显示,MO分别感染P62和Atg7沉默后的TC-1细胞12 h时,LC3II蛋白表达量均显著下降(p<0.01),表明P62、Atg7基因沉默后,抑制了MO诱导的细胞自噬。MO分别感染P62及Atg7基因沉默后的TC-1细胞,利用变色单元(CCU)试验检测MO的增殖。结果显示,MO在P62或Atg7基因沉默后的TC-1细胞中的增殖能力均显著增强(p<0.05),表明自噬对MO在TC-1细胞中的增殖起到一定的抑制作用。本实验为进一步揭示MO的感染机制提供新的研究思路,也为该病的治疗提供参考依据。

• 单位
  宁夏大学; 生命科学学院