兔关节软骨细胞的体外培养及凋亡相关基因在传代细胞中的表达

作者：周叶; 高越; 王晓楠; 朱立; 厉蓓

来源：浙江医学, 2017, 39(23): 2101-2191.

• 软骨细胞
• 体外培养
• 烟酰胺磷酸核糖转移酶
• 信息沉默因子1
• 传代

目的验证体外Ⅱ型胶原酶消化法培养兔软骨细胞的可行性,探讨凋亡及抗凋亡基因在软骨细胞传代中的变化,寻找关节软骨退变老化研究的最适宜靶细胞。方法在无菌条件下取6周龄新西兰大白兔双侧膝关节软骨,采用Ⅱ型胶原酶消化并机械吹打的方法分离关节软骨细胞并进行原代、传代培养;形态学观察时采用甲苯胺蓝染色法对关节软骨细胞进行鉴定;RT-PCR法检测P0P4代软骨细胞烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)、信息沉默因子1(Sirt1)、p53、Bax基因的mRNA相对表达量,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测各代关节软骨细胞增殖情况。结果显微镜下观察兔原代软骨细胞大多呈透亮椭圆形、短梭形、多角形特征,72h全部贴壁生长。甲苯胺蓝染色显示培养的软骨细胞细胞质染成浅蓝色,细胞核染成深蓝色;前3代软骨细胞表型稳定,增殖力良好;连续培养至P4代后,绝大部分细胞变为长梭形和不规则形状。随着软骨细胞的传代,NAMPT的表达量逐渐下调。与P0代软骨细胞相比,Sirt1的表达量在P1代细胞中明显上调,在P2代细胞急剧下降至P0代以下,在P3P4代细胞中Sirt1的表达量逐渐下调。凋亡基因p 53和Ba x的表达量随着软骨细胞的传代而上调。前3代软骨细胞增殖差异无统计学意义(均P>0.05);在培养到第47天时,P1P3代与P4代软骨细胞增殖差异有统计学意义(P<0.05)。结论采用体外Ⅱ型胶原酶消化法培养兔关节软骨细胞是切实可行的。随着软骨细胞的传代,抗凋亡基因NAMPT、Sirt1的表达逐渐下调,凋亡基因p53、Bax的表达逐渐上调。P1P3代关节软骨细胞作为研究关节软骨凋亡的细胞体系是合适的。

• 单位
  杭州市第一人民医院