人钾离子通道调节蛋白的原核表达及纯化

作者：郭林红; 周炜^*

来源：中国免疫学杂志, 2019, 35(11): 1348-1353.

• 钾离子通道调节蛋白
• 原核表达
• 蛋白纯化

目的:探讨人钾离子通道调节蛋白(KCNRG)的原核表达体系和纯化条件,为该蛋白的功能机制研究提供工具。方法:以pc DNA3. 1-KCNRG-2ex重组质粒为模板,采用特异引物扩增KCNRG基因编码区。PCR产物双酶切后克隆入p ET28a-MBP-His和p GEX-4T-1载体中。重组的p ET28a-KCNRG-MBP-His和p GEX-4T-1-KCNRG质粒转化Top10感受态细胞。鉴定阳性克隆,并选取测序正确的质粒转化Rosetta(DE3)蛋白表达菌株,IPTG诱导表达,用SDS-PAGE及Western blot检测重组融合蛋白的表达。结果:PCR扩增产物长度为819 bp。经双酶切和测序,鉴定重组质粒p ET28a-KCNRG-MBP-His和p GEX-4T-1-KCNRG构建成功。SDS-PAGE检测,KCNRG-MBP融合蛋白在菌液的上清中表达,KCNRG-GST融合蛋白主要以包涵体形式表达。Western blot检测,重组KCNRG-MBP蛋白和重组KCNRG-GST蛋白分别能被抗6×His抗体和抗GST抗体识别。经镍柱亲和层析纯化,获得纯化的KCNRG-MBP融合蛋白(凝胶成像系统软件分析纯化蛋白的纯度>90%)。结论:成功构建重组质粒p ET28a-KCNRG-MBP-His,并实现KCNRG-MBP融合蛋白的可溶性原核表达。

• 单位
  北京大学第一医院