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摘要
目的观察白介素(IL)10修饰的内皮祖细胞(EPC)对糖尿病大鼠视网膜病变的影响。方法采用密度梯度离心法从大鼠骨髓中提取并培养EPC,利用免疫荧光细胞化学染色法鉴定。取生长状态良好的EPC,每孔加入10μl慢病毒(LV)包装的IL10-绿色荧光蛋白(GFP)质粒(EPC-LV-IL10-GFP组)或LV包装的空白载体GFP质粒(EPC-LV-NC-GFP组),不加入任何质粒者作为EPC组。采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测量3组细胞培养基中肿瘤坏死因子(TNF)-α、IL10、IL8和血管内皮生长因子(VEGF)的表达。雄性Wistar大鼠168只分为正常对照组、糖尿病对照组、实验对照组及实验治疗组,分别为28、28、56、56只。后3组大鼠腹腔注射链脲佐菌素溶液建立糖尿病模型。建模成功后3个月,实验对照组、实验治疗组大鼠分别尾静脉注射EPC-LV-NC-GFP、EPC-LV-IL10-GFP;正常对照组、糖尿病对照组大鼠不给予任何干预。采用免疫组织化学染色法观察大鼠视网膜中GFP的表达;视网膜荧光染色铺片和伊凡思蓝(EB)定量检测大鼠血视网膜屏障的破坏程度;透射电子显微镜观察大鼠视网膜病理组织学的变化;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测大鼠视网膜组织中VEGF、金属蛋白酶(MMP)-9、血管生成素(Ang)-1、一氧化氮合酶(eNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA的表达。结果 ELISA检测结果显示,与EPC组、EPC-LV-NC-GFP组比较,EPC-LV-IL10-GFP组细胞培养基中TNF-α、IL8浓度明显下降(F=28.910、14.242,P<0.05);IL10、VEGF浓度明显升高(F=10.795、26.097,P<0.05)。免疫组织化学染色结果显示,正常对照组、糖尿病对照组大鼠视网膜组织GFP表达呈阴性;实验对照组、实验治疗组大鼠视网膜组织GFP表达呈阳性,主要表达在神经节细胞层、内核层及外丛状层。组间大鼠视网膜血管病理改变及EB平均渗漏量比较,糖尿病对照组较正常对照组明显加重(P<0.05),实验对照组及实验治疗组较糖尿病对照组明显减轻(P<0.05),干预后2、4周实验治疗组较实验对照组明显减轻(P<0.05)。与正常对照组比较,糖尿病对照组大鼠视网膜VEGF、MMP-9、Ang-1、iNOS mRNA表达明显提高(P<0.05),eNOS mRNA表达明显降低(P<0.05)。与糖尿病对照组比较,实验对照组、实验治疗组VEGF、iNOS mRNA表达明显降低,且以实验治疗组降低更为明显(P<0.05),Ang-1、MMP-9 mRNA表达无明显变化(P>0.05),eNOS mRNA表达明显提高,且以实验治疗组的提高最明显(P<0.05)。结论 IL10修饰的EPC通过改善视网膜炎性微环境可减轻糖尿病大鼠视网膜病变程度;外源性EPC植入可能弥补糖尿病视网膜病变发生后EPC数量相对不足的缺陷,加强治疗效果。
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单位天津医科大学总医院
