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摘要
【目的】水稻叶片是光合作用的重要场所,也是理想株型的重要构成因素,通过对卷叶相关基因进行遗传分析和精细定位,为水稻卷叶基因分子标记辅助育种提供紧密连锁标记。【方法】从60Co-γ射线辐射诱变籼稻品种9311(wild-type,WT)所得突变体库中获得了一份卷叶突变体材料,暂时命名为rl16(t)(rolled leaf 16)。首先,对突变体rl16(t)进行连续多代套袋自交,确定突变表型的稳定性。在抽穗期,随机选取rl16(t)和WT各10株,分别测量剑叶卷曲度以及主要农艺性状。同时取rl16(t)和WT新鲜叶片的相同部位用FAA固定,乙醇系列脱水,石蜡包埋,用石蜡切片机切10μm薄片置于载玻片上,番红染色后置于显微镜下,拍照观察叶片泡状细胞显微结构,对泡状细胞个数和面积进行统计和测量。在分蘖期各取10株rl16(t)和WT剑叶,测定叶绿素含量。以rl16(t)为母本与WT杂交,观察F1和F2植株的叶片表型,进行χ2测验,分析突变体的遗传行为。将卷叶突变体rl16(t)与粳稻品种滇粳优杂交F2分离群体作为定位群体,同时利用SSR标记结合新发展的In Del分子标记用于定位目的基因。利用基因表达定量对定位区间内的3个已知结构域基因和已克隆的水稻卷叶相关基因进行定量表达分析。【结果】与WT相比,rl16(t)叶片出现显著内卷,株高降低,穗长变短,结实率降低等表型变化。rl16(t)自苗期(3叶1心)整株就出现叶片纵向内卷成近似筒状的表型。随着发育进程,植株叶片始终呈现卷曲表型,而WT叶片在发育进程中则始终呈平展状。剑叶石蜡切片观察发现,rl16(t)泡状细胞数量和面积与WT相比均减少。WT的泡状细胞数量为(385.1±43.6)个/mm2,rl16(t)泡状细胞数量为(1059.5±254.4)个/mm2。rl16(t)除泡状细胞发生变化外,叶片其他细胞结构与WT相比均无显著性变化。突变体rl16(t)的类胡萝卜素含量低于WT,而叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素含量均显著高于WT。rl16(t)与WT杂交所得F1植株表现叶片平展,并且在包含423单株的F2中,分离出97株卷叶植株和326株平展叶植株,分离比符合3﹕1(χ2=0.86<χ20.05=3.84)。将Rl16(t)初步定位于第9染色体长臂SSR标记RM23769和RM23916之间,进一步扩大定位群体,最终将该卷叶基因定位在In Del标记DF70和SSR标记RM23818之间,该区段物理距离为51 kb。定位区间内有3个编码已知结构域的基因,分别是LOCOs09g09320、LOCOs09g09360和LOCOs09g09370。rl16(t)与WT在基因LOCOs09g09320与LOCOs09g09370的表达量上无显著性差异。而rl16(t)中LOCOs09g09360的表达量显著降低,只有WT的一半。对已克隆的8个卷叶基因进行表达定量分析,发现有7个基因(SLL1、ROC5、RL14、SRL1、ACL1、NRL1和NAL7)在rl16(t)中出现了不同程度的表达下调,只有OSZHD1表达上调。【结论】rl16(t)叶片发生内卷与泡状细胞数量变少,与面积变小相关。Rl16(t)是一个新的卷叶基因,LOCOs09g09360有可能是目标基因。
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单位南京农业大学; 作物遗传与种质创新国家重点实验室
