应用腺相关病毒-规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9系统基因治疗威尔森氏症的实验研究

作者：杨人杰; 史啸立; 殷爱红; 邓蕾; 李相成; 俞悦^*

来源：中华实验外科杂志, 2021, 38(01): 57-59.

DOI：10.3760/cma.j.cn421213-20200821-00624

• 威尔森氏症
• 基因治疗
• 腺相关病毒

目的应用腺相关病毒(AAV)-规律间隔成簇短回文重复序列及其相关核酸酶9(CRISPR/Cas9)系统体外实验研究基因治疗威尔森氏症(WD)。方法选用2月龄雄性Toxic milk (TX)小鼠作WD模型, 设计小向导RNA(sgRNA)并构建含有CRISPR元件的AAV载体质粒命名为pAAV-sgRNA1、2、3, 制备AAV, 病毒滴度达1～4×1013 GC/ml;感染WD肝细胞, 72 h后提取基因组DNA, 聚合酶链反应(PCR)后测序检测基因编辑效率, 筛选出其中活性最高者sgRNA1, 构建相应的同源修复模板(HT)质粒命名为pAAV-HT, 应用AAV-sgRNA1和AAV-HT共感染WD肝细胞, 测序和T7E1酶切检测模板修复效率;用HT特异性引物行PCR, 验证HT掺入。组间比较采用Student’st检验。结果 Sanger测序结果显示, sgRNA1在体外有最高的编辑效率[(20.2±2.3)%], 与sgRNA2、3比较[(3.1±1.3)%、(14.6±2.0)%], 差异有统计学意义(P<0.05)。进一步用HT进行基因修正, 能检出特异性修正后的ATP7B基因;二代测序测序显示修复率为(7.9±2.7)%。结论 AAV-CRISPR系统在体外可以达到较高编辑效率和修复效率。

• 单位
  南京医科大学第一附属医院