科研之友
微信
新浪微博
Facebook
分享链接
摘要
目的探讨低氧培养骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)来源的外泌体中miR-196b-5p对软骨细胞功能的影响及作用机制, 并分析其在软骨再生修复中的应用。方法将软骨细胞分别在常氧培养和低氧培养的BMSCs上清液中培养, 通过CCK-8检测软骨细胞的增殖能力, qPCR检测Ⅱ型胶原(collagen type 2, Col2)、Col1、Aggrecan、SOX9的表达情况, 评估低氧培养后BMSCs的外泌体对软骨细胞功能的影响。通过超速离心法获取常氧外泌体和低氧外泌体, 采用CCK-8和qPCR检测对比低氧BMSCs外泌体和常氧BMSCs外泌体对软骨细胞增殖及合成代谢相关基因表达的促进作用。验证外泌体miRNA测序结果中低氧外泌体miR-196b-5p的表达情况, 敲除低氧BMSCs中miR-196b-5p进行功能抑制实验, 对比miR-196b-5p在低氧外泌体促进软骨细胞功能中发挥的作用。使用生物信息学工具预测并验证miR-196b-5p下游靶点。通过转染siRNA分析低氧BMSCs外泌体中miR-196b-5p促进软骨细胞功能的作用机制。采用丝素水凝胶负载低氧外泌体及低表达miR-196b-5p的低氧外泌体, 注入裸鼠皮下后培养4周后对取出的组织块行番红O、马松组织学染色及硫酸糖胺聚糖、胶原生化含量检测, 评估低氧外泌体及miR-196b-5p在软骨再生修复中的应用情况。结果低氧组软骨细胞吸光度为1.20±0.07, 较常氧组的0.94±0.04高, 差异有统计学意义(P<0.05);低氧组软骨细胞Col2(2.95±0.17)、Aggrecan(2.45±0.27)、SOX9(2.92±0.29)的表达高于常氧组(1.89±0.09、1.67±0.21、1.76±0.16), 差异有统计学意义(P<0.05)。CCK-8示低氧外泌体组软骨细胞的增殖能力(1.28±0.04)较常氧外泌体组(1.05±0.06)更高, 差异有统计学意义(P<0.05)。PmirGLO-BACH1-WT报告载体与miR-196b-5p mimics共转染后(0.73±0.06)的荧光素酶活性降低, 差异有统计学意义(P<0.05);PmirGLO-BACH1-MUT报告载体与miR-196b-5p mimics共转染后, 荧光素酶活性无变化, BACH1为miR-196b-5p下游靶点;裸鼠皮下组织培养生化含量分析显示低氧BMSCs外泌体组软骨基质sGAG(383.2±21.54)和胶原含量(67.40±3.45)增多, 低氧BMSCs外泌体miR-196b-5p敲低组sGAG(258.4±19.50)和胶原含量(57.15±4.95)降低, 差异均有统计学意义(P<0.05)。结论低氧外泌体通过miR-196b-5p抑制软骨细胞中BACH1的表达, 促进软骨细胞功能, 可应用于软骨再生修复。
-
单位南京医科大学第一附属医院; 江苏大学
