稳定高效合成多巴胺的骨髓间充质干细胞系的创建和鉴定

作者：刘阳; 常俊彦; 王悦; 杨盼; 马彩云; 刘高峰; 郭俣; 刘长青; 王春景^*

来源：生物工程学报, 2023, 39(04): 1773-1788.

DOI：10.13345/j.cjb.220718

• 帕金森病
• 大鼠间充质干细胞
• 酪氨酸羟化酶
• 多巴胺脱羧酶
• GTP环化水解酶1
• 多巴胺

创建能稳定合成多巴胺(dopamine,DA)递质的三转基因(tyrosine hydroxylase/dopamine decarboxylase/GTP cyclohydrolase 1,TH/DDC/GCH1)的骨髓间充质干细胞系(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)，移植至帕金森大鼠模型脑内，为帕金森病(Parkinson’s disease,PD)的临床治疗提供实验依据。通过三转基因的重组慢病毒创建能稳定合成并分泌DA递质的DA-BMSCs稳定转染细胞系，利用反转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blotting)、免疫荧光等技术检测BMSCs中三转基因(TH/DDC/GCH1)的表达，采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测DA的合成情况。染色体G-带法检测DA-BMSCs的遗传稳定性。将DA-BMSCs移植于6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)偏侧损毁帕金森大鼠模型右脑的前脑内侧束(medial forebrain bundle,MFB)区，检测其在PD大鼠脑内微环境中的存活、分化情况。阿扑吗啡(apomorphine,APO)诱导旋转实验检测DA-BMSCs移植后PD大鼠的运动障碍改善情况。DA-BMSCs细胞系中TH/DDC/GCH1三转基因均能够稳定高效表达，而正常BMSCs对照组中均不表达。三转基因感染组(DA-BMSCs)和LV-TH感染组细胞培养上清液中DA浓度极其显著高于BMSCs空白对照组(P<0.000 1)。传代后的DA-BMSCs仍能稳定合成DA，并保持正常二倍体核型(94.5%)。DA-BMSCs移植PD大鼠脑内4周后，显著改善PD大鼠模型的运动障碍，在脑内微环境中大量存活，分化为TH+和GFAP+细胞，并显著上调脑移植区域的DA水平。本研究成功创建了能稳定分泌DA，在大鼠脑中大量存活并分化的三转基因DA-BMSCs细胞系，为DA-BMSCs工程化培养与移植治疗PD奠定基础。

• 单位
  生命科学学院; 蚌埠医学院