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摘要
目的探讨TGF-β1诱导的黄韧带细胞增生效应及其对结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)表达的影响。方法取腰椎椎间盘突出髓核摘除术中的黄韧带组织,采用胶原酶预消化组织块培养法分离培养黄韧带细胞。采用形态学观察、免疫荧光染色观察、MTT法检测细胞增殖情况进行细胞鉴定。取第3代黄韧带细胞分为5组,A、B、C、D组分别于细胞中加入3 ng/mL TGF-β1、50 ng/mL CTGF、3 ng/mL TGF-β1+CTGF中和抗体(1∶500)封闭、50 ng/mL CTGF+CTGF中和抗体(1∶500)封闭,E组加入无血清DMEM作为对照。采用MTT法检测TGF-β1和CTGF对黄韧带细胞增殖的影响,Western blot检测CTGF蛋白表达,实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、CTGF基因表达。结果培养的黄韧带细胞形态呈多样性,均表现出典型的黄韧带成纤维细胞表型;所有细胞均表达Ⅰ型胶原蛋白及波形蛋白,部分细胞表达Ⅲ型胶原蛋白;MTT鉴定示随培养时间延长,各代细胞吸光度(A)值均逐渐增加,同代细胞各时间点间A值比较差异均有统计学意义(P<0.05),相同时间点各代细胞间A值比较差异均无统计学意义(P>0.05)。培养24 h MTT法检测示A、B组细胞A值显著高于E组(P<0.05);而加入CTGF中和抗体后,C、D组A值降低,但仍高于E组(P<0.05);A、C组间及B、D组间比较差异亦有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测示A、B组CTGF蛋白相对表达量明显高于E组(P<0.05);而加入CTGF中和抗体后,C、D组CTGF蛋白相对表达量显著降低,但仍高于E组(P<0.05);A、C组间及B、D组间比较差异亦有统计学意义(P<0.05)。qRT-PCR检测示,与E组比较,A组CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA相对表达量均显著增高(P<0.05);加入CTGF中和抗体后,C组各基因表达受到抑制,mRNA相对表达量显著低于A组,但仍显著高于E组(P<0.05)。B组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA相对表达量显著高于E组(P<0.05),但CTGF mRNA相对表达量与E组比较差异无统计学意义(P>0.05);加入CTGF中和抗体后,D组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA相对表达量受到抑制,低于B组,但仍显著高于E组(P<0.05),CTGF mRNA相对表达量与B、E组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 TGF-β1可促进黄韧带细胞的CTGF、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原基因及蛋白表达水平增加,TGF-β1通过CTGF协同促进黄韧带细胞增生。
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