大豆疫霉菌氧化固醇结合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化及活性鉴定

作者：丁鲜; 刘西莉; 张峰^*

来源：农药学学报, 2023, 25(03): 602-610.

DOI：10.16801/j.issn.1008-7303.2023.0037

• 大豆疫霉菌
• 氧化固醇结合蛋白
• 大肠杆菌
• 表达纯化
• 稳定性
• 生物活性

氟噻唑吡乙酮(oxathiapiprolin)是目前生产上防治植物病原卵菌病害的高活性杀菌剂，其靶标被认为是氧化固醇结合蛋白(oxysterol-binding protein, OSBP)。氧化固醇结合蛋白及其相关蛋白(OSBP-related proteins, ORPs)是一种脂质转运蛋白，保守存在于多个物种中。虽然其他部分物种的该蛋白三维结构已经被解析，然而尚未见有关植物病原卵菌中该蛋白异源表达及纯化的报道，因而限制了该蛋白的结构药理学研究及基于靶标的新型杀菌剂开发。本文旨在建立大豆疫霉菌(Phytophthora sojae, Ps)氧化固醇结合蛋白Psosbp的异源表达、纯化及活性鉴定体系。研究选取与人源OSBP序列保守的OSBP相关结构域(oxysterol-binding protein-related domain, ORD)，构建适于在大肠杆菌Escherichia coli中表达的质粒并通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，使用亲和层析及凝胶过滤层析对目的蛋白进行纯化，使用SDSPAGE及Western blot对蛋白进行种类鉴定，分别使用TychoTM NT.6及微量热泳动技术对蛋白进行结构完整性及活性鉴定。结果表明，选取了Psosbp蛋白序列的第600位至967位氨基酸，即Psosbp(600-967)作为Psosbp的ORD结构域，构建了表达质粒pET28a-MBP-TEVPsosbp(600-967)-His6。IPTG可诱导目的蛋白的表达且蛋白均为可溶状态，使用Ni-NTA琼脂糖树脂对蛋白进行亲和纯化，并基于分子质量大小，通过分子排阻色谱进一步分离获得了纯度较高的重组蛋白MBP-TEV-Psosbp(600-967)-His6。TychoTM NT.6测定结果表明，重组蛋白具有完整的蛋白质高级结构；微量热泳动结果表明，氟噻唑吡乙酮可以与重组蛋白结合，说明所纯化出的Psosbp蛋白具有生物活性。综上，本文建立了植物病原卵菌的氧化固醇结合蛋白异源表达纯化及活性鉴定体系，并直接证实了抑制剂氟噻唑吡乙酮可结合氧化固醇结合蛋白。

• 单位
  中国农业大学; 南京农业大学