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摘要
目的探讨干扰S期激酶相关蛋白1(S-phase kinase associated protein 1, SKP1)基因对1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)诱导致帕金森病(Parkinson’’s disease, PD)细胞模型凋亡及泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)降解α-突触核蛋白(α-synuclein, α-syn)机制的影响。方法将SH-SY5Y细胞分为对照组、MPP+组、SKP1干扰组、SKP1干扰+ MG132(UPS抑制剂)组, 对照组细胞正常培养, 后三组细胞先用MPP+(0.5 mmol/L)孵育24 h作为PD模型细胞, SKP1干扰组转染慢病毒SKP1-siRNA, SKP1干扰+MG132组转染慢病毒SKP1- siRNA后加入MG132(0.5 μmol/L)干预24 h。采用RT-PCR和Western blot检测细胞中SKP1、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein l light chain 3, LC3)、溶酶体相关膜蛋白2(lysosome-associated membrane protein, LAMP2)、α-syn、泛素激活酶E1(ubiquitin activating enzyme E1, UBE1)、parkin、p27的基因和蛋白表达水平;流式细胞仪检测细胞凋亡与细胞周期水平, CCK-8法检测细胞增殖水平;采用免疫共沉淀法探究SKP1与p27的相互作用。使用SPSS 23.0软件进行统计学分析, 多组间比较采用单因素方差分析, 进一步两两比较采用LSD检验。结果 RT-PCR和Western blot结果显示, 四组细胞的自噬相关蛋白及泛素相关蛋白LC3、LAMP2、α-syn、UBE1、parkin、p27的mRNA(F=99.155, 43.028, 138.464, 28.200, 22.009, 28.147, 均P<0.05)和蛋白(F=245.517, 157.634, 315.920, 2 336.472, 477.429, 2 350.201, 均P<0.05)表达水平均差异有统计学意义。SKP1干扰组LC3、LAMP2、α-syn、p27的mRNA和蛋白表达水平均低于MPP+组(均P<0.05), UBE1、parkin的mRNA和蛋白表达水平均高于MPP+组(均P<0.05);SKP1干扰+ MG132组LC3、α-syn、p27的mRNA和蛋白表达水平均高于SKP1干扰组(均P<0.05), UBE1、parkin的mRNA和蛋白表达水平均低于SKP1干扰组(均P<0.05)。流式细胞术和CCK-8法检测结果显示, 四组间细胞凋亡率和细胞抑制率均差异具有统计学意义(F=2 749.420, 171.508, 均P<0.05)。SKP1干扰组细胞凋亡率低于MPP+组[(8.22±0.25)%, (15.30±0.21)%, P<0.05], 而细胞抑制率低于MPP+组[(26.31±3.73)%, (55.05±3.84)%, P<0.05]。SKP1干扰+ MG132组细胞凋亡率[(9.49±0.07)%]高于SKP1干扰组, 细胞抑制率[(36.06±2.85)%]高于SKP1干扰组(均P<0.05)。免疫共沉淀法结果显示, SKP1免疫沉淀后, p27随之减少。结论干扰SKP1基因后, PD细胞自噬功能降低, 可能与parkin促使α-syn发生泛素化, 激活UBE1/parkin介导UPS通路降解α-syn, 并介导P27抑制细胞凋亡有关。
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单位南京医科大学; 神经内科; 淮安市第一人民医院
