HRP标记的二抗检测heme结合蛋白造成假阳性问题的探讨

作者：张亚男; 张春晓; 陈晓波^*

来源：河北科技大学学报, 2019, 40(03): 273-278.

• 植物生物化学
• 蛋白免疫印迹杂交
• 辣根过氧化物酶
• heme结合蛋白
• 假阳性

为了验证对辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)作为二抗标记物在检测heme结合蛋白时产生假阳性问题的推测,以菠菜细胞色素b6f复合体(Cyt b6f)和铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶(FNR)为检测对象(前者含有heme结合蛋白Cyt f,后者不含heme基团),采用菠菜FNR一抗、HRP和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)标记的二抗,设计对比实验。结果表明,在使用HRP标记的二抗体系中,Cyt f不经一抗和二抗孵育即可显色,这是明显的假阳性;而在ALP标记的二抗体系中,Cyt f条带不显色,只有FNR条带显色。在western blot实验中,如果被检测蛋白为heme结合蛋白或者混有少量heme结合蛋白,应避免采用HRP标记的二抗,建议使用ALP标记的二抗或者其他二抗产品;heme结合蛋白具有类似HRP的氧化还原酶活性,其本身可以和显色液反应,从而产生假阳性,干扰对实验结果的判断。

• 单位
  河北科技大学