小胶质细胞Stat3基因条件性敲除小鼠的构建及鉴定

作者：朱晓晨; 谢欣宜; 赵旭日; 徐丽娜; 何智妍; 周薇^*

来源：上海交通大学学报 (医学版), 2023, 43(06): 689-698.

DOI：10.3969/j.issn.1674-8115.2023.06.005

• 小胶质细胞
• 信号转导和转录激活因子3(STAT3)
• 他莫昔芬
• 小鼠
• Cre重组酶

目的·基于Cre-Loxp系统构建小胶质细胞Stat3基因条件性敲除小鼠并验证其敲除效率。方法·将Cx3cr1creERT2与Stat3fl/fl基因型小鼠多代交配繁育，直到获得足够数量的Stat3fl/fl;Cx3cr1creERT2基因型小鼠，即条件敲除小鼠(conditional knockout,CKO)；同窝Stat3 fl/fl基因型小鼠，即对照小鼠(wild type,WT)。利用小鼠组织提取DNA后通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，结合特异性引物分别扩增的结果来判断小鼠基因型。在CKO及WT小鼠6周龄时通过腹腔注射他莫昔芬诱导小胶质细胞中Stat3基因的敲除；2周后，随机选取CKO小鼠(n=4)及WT小鼠(n=4)，利用磁珠分选法(magnetic activated cell sorting,MACS)分选出小胶质细胞后通过实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)技术从基因水平检测基因敲除效率；通过脑组织切片免疫荧光染色标记小胶质细胞和STAT3蛋白观察小胶质细胞中STAT3的表达情况；利用流式细胞术分别检测STAT3在小胶质细胞及脾巨噬细胞中的变化。通过尼氏染色检测神经元细胞的情况；通过脑组织切片荧光染色标记小胶质细胞，观察皮层和海马区域小胶质细胞的情况；通过流式细胞术检测小胶质细胞表型。结果·成功繁育出CKO小鼠和WT小鼠。MACS后脑细胞中小胶质细胞的占比从10%提升到85%。RT-PCR结果显示，相对于WT小鼠，CKO小鼠小胶质细胞中Stat3的mRNA相对表达量为0.331 7±0.041 4,mRNA水平下调(P=0.001)。脑组织免疫荧光染色结果显示，CKO小鼠小胶质细胞中STAT3蛋白的荧光强度较WT小鼠弱。脑组织流式细胞术显示：WT小鼠小胶质细胞中STAT3的阳性细胞占比为(85.30±5.69)%;CKO小鼠小胶质细胞中STAT3的阳性细胞占比为(39.70±3.88)%,STAT3表达率下降(P=0.001)。脾组织流式细胞术显示，CKO小鼠与WT小鼠脾巨噬细胞中STAT3的阳性细胞占比的差异无统计学意义(P>0.05)。尼氏染色显示，CKO小鼠与WT小鼠神经元细胞无显著差异。脑组织切片荧光染色结果显示，CKO小鼠与WT小鼠的小胶质细胞在形态上无明显差异。小胶质细胞流式细胞术显示CKO小鼠与WT小鼠小胶质细胞表型无显著差别。结论·成功构建小胶质细胞Stat3基因条件性敲除小鼠，为后续相关研究提供动物模型。

• 单位
  上海交通大学医学院附属第九人民医院; 上海交通大学; 上海市口腔医学研究所