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摘要
甘蔗线条花叶病毒（Sugarcane streak mosaic virus, SCSMV）是引起甘蔗花叶病的一种主要病原。SCSMV编码的P1蛋白是RNA沉默抑制子，在SCSMV抑制寄主的RNA沉默防御中发挥关键作用，但其作用机制尚未清楚。与寄主蛋白互作是RNA沉默抑制子发挥其抑制作用的主要途径之一，因此鉴定与病毒RNA沉默抑制子互作的寄主蛋白是研究抑制子作用机制的一个重要方法。为探究SCSMVP1抑制寄主RNA沉默的机制，本研究首先将SCSMVP1基因连接到质粒pGBKT7上构建诱饵质粒pGBKT7-P1，然后对pGBKT7-P1进行毒性和自激活检测，最后以pGBKT7-P1为诱饵，采用酵母双杂交技术从甘蔗cDNA文库中筛选与P1互作的寄主蛋白。结果显示，成功构建pGBKT7-P1诱饵质粒。将pGBKT7-P1诱饵质粒转入Y2HGold酵母菌株后，酵母菌株在SD/-Trp平板及液体培养基中生长良好，表明pGBKT7-P1诱饵质粒对Y2HGold酵母菌株无毒性。含pGBKT7-P1诱饵质粒的酵母菌株在SD/-Trp/X-α-Gal平板上长出白色菌落未变蓝，在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA和SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA平板上无菌落生长，表明pGBKT7-P1诱饵质粒无自激活活性。用pGBKT7-P1诱饵质粒对甘蔗cDNA文库进行筛选，经SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/AbA平板筛选1次及SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA平板筛选3次后，获得42个阳性酵母克隆，提取阳性酵母质粒并导入大肠杆菌中扩大培养，经测序及blastx比对分析，获得13个可能与SCSMV P1互作的寄主甘蔗蛋白，分别是生长素应答蛋白IAA1、IAA15，转录因子NAC、GATA4、OFP4，真核翻译起始因子eIF5A，分子伴侣DnaJ，辅分子伴侣SBA1，重金属相关异戊二烯化植物蛋白HIPP35,mec-8和unc-52蛋白同系物抑制子SMU2，外膜孔蛋白OEP24，及2个未表征蛋白。基于这些蛋白的功能，推测P1可能通过与寄主蛋白互作来调控寄主防御反应相关基因的表达，和/或通过与寄主蛋白互作来影响寄主RNA沉默相关蛋白的合成、加工或转运，从而发挥其RNA沉默抑制子的功能。研究结果为后续深入解析P1抑制RNA沉默的作用机制奠定了重要基础。
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