转牛LDHA基因酿酒酵母构建及产乳酸能力分析

作者：左梦娜; 何佳宁; 尹千禧; 王凤梅; 马利兵^*

来源：南方农业学报, 2023, 1-10.

• 牛
• 酿酒酵母
• 乳糖脱氢酶A(LDHA)
• 乳酸

【目的】探究以商业化转基因酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)发酵制备食品级乳酸的可行性，为采用转基因商业酿酒酵母制备乳酸提供理论及技术基础。【方法】从NCBI下载牛(Bos taurus)乳酸脱氢酶A(lactate dehydrogenase A，LDHA)基因的编码序列并对该酶的理化参数、二级结构及三级结构进行预测，将编码序列中的同义密码子替换为酿酒酵母的偏好密码子，经人工合成后，导入酿酒酵母表达载体pAUR123。重组的pAUR123载体导入感受态商业化酿酒酵母EC1118菌株后，采用抗生素Aureobasidin A筛选转基因酿酒酵母。提取转基因酿酒酵母中的重组pAUR123载体，后者经EcoR I单酶切或Sac I及Kpn I双酶切后，琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段大小。采用含200 g/L葡萄糖的YPD液体培养基对转基因及非转基因酿酒酵母连续培养5 d，于培养24 h后，检测2组酿酒酵母中的LDHA活性；每24 h检测发酵液中的酿酒酵母细胞密度、酒精浓度，乳酸浓度及葡萄糖浓度。【结果】牛LDHA基因编码序列为1170 bp，共编码389个氨基酸残基。该酶在酵母细胞中较为稳定，二级结构中富含α-螺旋及无规卷曲，β-折叠占比较少。该酶的编码序列由酿酒酵母表达载体pAUR123携带导入酿酒酵母中，采用抗生素Aureobasidin A成功筛选到1株转基因酿酒酵母，导入其中的重组pAUR123载体经酶切后，酶切片段大小符合预期，表明LDHA基因成功导入该酿酒酵母菌株中。发酵结果表明，发酵24 h后，转基因酿酒酵母中LDHA活性可达4.7±1.2 mU/mg酵母总蛋白；LDHA基因的导入并未影响转基因酿酒酵母的发酵能力；于发酵2-3 d后，转基因酿酒酵母可以200 g/L葡萄糖为碳源，制备约30 g/L乳酸。【结论】转牛LDHA基因的商业化酿酒酵母可用于发酵制备乳酸。

• 单位
  内蒙古科技大学; 包头轻工职业技术学院