弓形虫ROP16Ⅰ/Ⅱ蛋白对RAW 264.7细胞增殖与凋亡的影响及相关机制

作者：李佳铭; 杨宁爱; 汪澎涛; 王艺璇; 马慧慧; 刘春兰; 兰敏; 赵志军^*

来源：中国病原生物学杂志, 2023, 18(01): 30-36.

DOI：10.13350/j.cjpb.230106

• 刚地弓形虫
• ROP16
• RAW 264.7细胞
• 凋亡
• STAT3
• NF-κB

目的 探讨弓形虫Ⅰ、Ⅱ型ROP16蛋白对小鼠腹腔巨噬细胞RAW 264.7细胞增殖和凋亡的影响及相关机制。方法 用构建的Ⅰ、Ⅱ型ROP16重组慢病毒表达载体转染RAW 264.7细胞，经嘌呤霉素筛选稳定后获得单克隆过表达细胞株。qRT-PCR和Western blot法鉴定过表达效果，免疫光法检测其定位，cck-8法测定细胞增殖活性，流式细胞术检测细胞凋亡变化水平。Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白Caspase 3、Caspase 9、Bax、Bcl-2和信号通路相关蛋白pTyr705-STAT3、total-STAT3、p-NF-κB p65和NF-κB p65的相对表达水平，qRT-PCR法检测细胞凋亡相关基因Caspase 3、Caspase 9、Bax、Bcl-2的相对转录水平。结果 重组慢病毒表达载体转染RAW 264.7细胞后可观察到强绿色荧光，并检测到rop16基因转录与蛋白表达，且该蛋白主要定位于RAW 264.7细胞核及其周围。cck-8检测显示，Ⅰ、Ⅱ型ROP16蛋白均可促进RAW 264.7细胞增殖。流式细胞术检测显示，过表达overExp-ROP16Ⅰ组细胞凋亡率为(5.35±0.0529)%,过表达组overExp-ROP16Ⅱ组细胞凋亡率为(5.2767±0.0651)%,均显著低于空白对照组(10.4733±0.2178)%和空载体对照组(10.6533±0.0702)%(均P<0.01)。Western blot及qRT-PCR检测显示过表达overExp-ROP16Ⅰ/Ⅱ组促凋亡因子Caspase 3、Caspase 9、Bax蛋白及其mRNA均显著升高，抗凋亡因子Bcl-2蛋白及其mRNA表达受抑制(均P<0.01)。Western blot检测过表达overExp-ROP16Ⅰ组pTyr705-STAT3蛋白相对表达水平显著高于对照组(P<0.01),过表达overExp-ROP16Ⅱ组p-NF-κB p65蛋白相对表达水平显著高于对照组(P<0.01)。结论 Ⅰ型和Ⅱ型ROP16蛋白可促进RAW 264.7细胞增殖并抑制其凋亡。

• 单位
  宁夏临床病原微生物重点实验室; 宁夏医科大学总医院; 宁夏医科大学