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摘要
研究背景 创伤性脑损伤（TBI）是致死致残率很高的一种常见病。除原发性脑损伤外，继发性脑损伤对TBI的预后也起着重要影响。目前有关TBI的发生发展机理至今尚未完全明确，国内外有多种学说，如：血脑屏障学说，钙通道学说，自由基学说，脑微循环学说，能量代谢学说等。但上述学说没有一种能完全解释清TBI发病机理，这是因为创伤性脑水肿的发生机理是十分复杂的。上述的各种机制并非孤立存在、单独起作用，而是相互影响、多种机制共同起作用的结果。近年来，神经源性炎症在TBI中的作用机制逐渐引起人们的重视，越来越多的研究发现，神经肽Y（NPY）、降钙素相关基因肽（CGRP）、P物质（SP）、水通道蛋白-4（AQP4）和核转录因子-κB（NF-κB）等在TBI后神经源性炎症中扮演重要角色。本课题提出“创伤性脑损伤的神经源性机制”假说，正是基于神经源性炎症。假说主要内容：TBI后，脑组织内许多神经化学和细胞介质发生改变，并且组织内发生类似神经源性炎症反应或者/和疼痛作为应激性刺激通过复杂的神经源性机制诱发的脑组织内神经递质分泌异常，导致或者加剧脑组织内生物学活性物质产生与代谢失衡，引起脑细胞的损伤，从而加剧损伤区脑组织的损伤，并且引起损伤区周围脑组织的损伤反应，引发创伤性脑水肿，造成继发性颅脑损害，即①神经源性炎症或损伤刺激直接或经传导作用于脑细胞→胞体分泌神经肽增加→神经突触间神经递质释放增多→离子通道活动增加→动作电位活动增加，并由突触部位扩散到胞体→胞体钠、钙通道活动增加→导致水钠储留，钙超载→细胞性脑水肿。②神经源性炎症产生的生物学活性物质（如SP）作用于脑血管及水通道-4（AQP4）→AQP4活动增强（在朝向血管面及软脑膜面的胶质细胞膜区有选择性的高表达），脑血管通透性增加，胶质细胞水肿→血脑屏障（BBB）通透性增加，血管内容渗出增多，间隙性水肿→血管源性脑水肿。①②共同导致创伤性脑水肿，引起颅内高压，此时如不采取措施（脱水、激素、手术）阻止其发展，那将会有更多的脑细胞死亡，炎症加剧，水肿加重，形成恶性循环，直至脑疝死亡。如果上述假设成立，通过干预或阻断上述环节均可能减轻组织损伤，这为我们寻找开发新药治疗创伤性脑损伤提供了新的思路。 研究目的： 1、探讨创伤性脑损伤的神经源性机制，即颅脑创伤导致创伤性脑水肿引起脑组织损伤性改变的具体机制。（第一部分实验要解决的问题） 2、探讨使用各种受体拮抗剂，能否减轻和抑制上述损伤性改变。（第二部分实验要解决的问题） 研究方法： 1.第一部分实验，采用Wistar雄性大鼠40只，体重280±10g，随机分为4组：对照组（C组），轻度创伤组（M1组），中度创伤(M2组),重度创伤组（S组），以上4组每组10只。用Feeney按自由落体致伤原理制作TBI大鼠模型，伤后记录丘脑腹后内侧核（VPM）痛敏神经元（PSN）放电频率，1h后断头取血，开颅取脑。通过肉眼大体观测各组大鼠脑皮层损伤处及其周边脑组织损伤程度；光镜苏木精—伊红染色法(HE)从组织细胞水平观测大鼠脑组织损伤程度;透射电镜超微结构水平观测大鼠脑皮层损伤处及其周边脑组织损伤程度;免疫组化检测大鼠脑皮层损伤处及其周边脑细胞中SP、 NPY、CGRP、NF-κB、AQP4阳性表达情况; Western blot检测大脑皮质损伤区AQP4蛋白表达情况; RT-PCR检测SP、NPY、CGRP、NF-κB、NSE和AQP-4基因表达水平; ELISA法测定血清中神经元特异性烯醇化酶（NSE）、缓激肽（BK）、前列腺素E2（PGE2）、组织胺（HA）、基质金属蛋白酶（MMP-9）、高敏C反应蛋白（hs-CRP）含量;激光共聚焦荧光离子成像实验测定脑细胞内Ca++浓度，检测钙超载情况;流式细胞仪检测大鼠脑皮层细胞亚二倍体比率，了解脑细胞凋亡情况;多通道电生理记录仪记录分析VPM核痛敏神经元放电频率。对上述各项指标进行统计学分析，做相关性研究。从组织形态学、蛋白学、基因学、血清学、神经电生理学、超微结构多角度研究创伤性脑损伤的神经源性机制。 2．第二部分第一章干预实验--NK1受体拮抗剂L-703,606对大鼠创伤性脑损伤保护作用机制的实验研究，采用45只Wistar雄性大鼠，体重280±10g，随机分为3组：对照组（C组），L-703,606干预组（L组），TBI创伤未干预组(T组),以上3组每组15只。TBI造模成功后立即尾静脉给予NK1受体拮抗剂L-703,606(250nmol/kg Sigma公司),然后于造模后1h断头取血，开颅取脑，HE染色观察各组鼠脑损伤情况；免疫组化染色检测SP、CGRP、NF-κB表达情况；RT-PCR检测SP、CGRP、NF-κB、NSE、AQP4mRNA基因表达；ELISA法测定血清中NSE、hs-CRP；统计学分析上述指标，研究P物质受体-NK1受体拮抗剂L-703,606干预效果。 3.第二部分第二章干预实验--Rho激酶抑制剂对创伤性脑损伤后脑细胞内亚二倍体比率的影响及其意义，采用健康成年雄性Wistar大鼠45只，体重280±10g,随机分为3组，即假手术组（Sham组），创伤组（TBI组）和Rho激酶抑制剂干预组（FSD组），每组15只。造模后采用流式细胞仪（FCM)检测鼠脑创伤区皮层细胞亚二倍体比率，了解使用Rho激酶抑制剂（Fasudil）后使TBI细胞凋亡改善情况。 研究结果 1．第一部分实验结果显示，随打击程度加重，鼠脑水肿越明显、脑细胞、线粒体肿胀越明显，并可见神经突触间释放神经递质及炎症细胞浸润； SP、NPY、CGRP、NF-κB、AQP4、NSE基因表达与蛋白阳性表达成正相关性，且损伤越重，基因表达越强，其对应的阳性蛋白含量表达也越多;致痛物质BK、PGE2、HA与致痛致炎神经递质-SP基因蛋白表达水平成正相关；SP与VPM核痛敏神经元放电频率成正相关性，致痛物质-P物质表达含量越高，VPM核痛敏神经元放电频率越高；SP与神经肽-NPY、CGRP之间成正相关性，P物质表达及释放越多，神经肽NPY和CGRP表达越多；SP与炎症因子-核转录因子KB(NF-κB)及炎症反应指标-高敏感性C反应蛋白（hs-CRP）之间成正相关性，P物质表达及释放越多，炎症反应指标hs-CRP和NF-κB表达越高，炎症反应越严重，NF-κB与hs-CRP之间也呈正相关性，NF-κB表达越多，血清hs-CRP含量越高，炎症反应越重；SP与基质蛋白水解酶9(MMP-9)、水通道蛋白AQP4表达之间成正相关性，P物质表达及释放越多，MMP-9含量增多，降解和破坏血管内皮基膜的能力越强，引起血管通透性增加，炎性物质渗出增多，导致血管源性脑水肿,P物质表达越多可引起AQP4表达也增多，引起细胞膜通透性增高，导致细胞性脑水肿; SP与损伤皮层脑细胞钙离子含量及细胞凋亡指标-亚二倍体（Hd）比率之间成正相关性，P物质表达及释放越多，损伤皮层脑细胞钙离子含量越高（钙超载现象越严重），脑细胞亚二倍体（Hd）比率也越高（细胞凋亡越严重）；SP与神经元特异性烯醇化酶（NSE）之间成正相关，P物质表达越多，炎症反应越严重，神经细胞坏死越多，NSE表达及含量也越高; NPY、CGRP与NF-κB之间成正相关性，TBI后NPY、CGRP表达越高，NF-κB表达也越高，炎症反应也越重；NF-κB与NSE、AQP4、钙离子浓度、亚二倍体（Hd）比率之间成正相关性，TBI后NF-κB表达越高，炎症反应越重，NSE(反映神经细胞损伤)、AQP4（反映细胞性脑水肿）、钙离子浓度（反映钙超载）和亚二倍体（反映脑细胞凋亡）比率也越高。（P均﹤0.05） 2.第二部分L-703,606对大鼠创伤性脑损伤保护作用机制的实验研究，结果显示L-703,606干预组（L组）明显较TBI未干预组（T组）损伤减轻，仅有轻度充血，少量炎性细胞浸润; L组和T组大鼠脑皮层损伤区脑组织SP、CGRP和NF-κB阳性表达较对照组阳性表达有明显增强（P﹤0.05），L组较T组表达明显降低；L组和T组大鼠脑皮层损伤区脑组织SP、CGRP、NF-κB、AQP-4和NSE基因表达水平较对照组阳性表达有明显增强（P﹤0.05），且L组较T组表达明显降低（P﹤0.05）；L组和T组大鼠血清中hs-CRP和NSE含量较对照组明显增高（P﹤0.05），且L组较T组hs-CRP和NSE含量明显降低。 3.第二部分Rho激酶抑制剂对创伤性脑损伤后脑细胞内亚二倍体比率的影响及其意义实验研究结果显示，Sham组、TBI组和FSD组的创伤区皮层细胞亚二倍体比率（%）分别为1.58±0.35，15.90±3.91和5.35±2.10，三组间差异有统计学意义（P<0.01），且FSD组能较TBI组明显降低脑细胞内亚二倍体比率，因而可减轻TBI后脑细胞凋亡，具有脑保护作用。 结论 1．神经源性炎症、神经源性机制在创伤性脑损伤中发挥重要作用； 2. NK1受体拮抗剂L-703,606对大鼠创伤性脑损伤具有保护作用； 3. Rho激酶抑制剂（Fasudil）能降低脑细胞内亚二倍体比率，对TBI后脑组织具有保护作用； 4.其他受体拮抗剂，如CGRP拮抗剂CGRP8-37、NPY拮抗剂BIBP3226,芬太尼痛觉干预,PDTC干预NF-κB,小剂量多巴胺抑制APQ4表达，骨髓间充质干细胞（BMSC）联合血管内皮生长因子（VEGF）或其他神经营养因子移植治疗TBI，均能起到抑制神经源性炎症，保护脑细胞作用（详见本人已发表之相关论文）。期望通过深入研究创伤性脑损伤神经源性机制，找到更多、更高效的治疗TBI的药物和方法，开发新药，为广大TBI患者带来福音。
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