RHBDF2-shRNA慢病毒载体的构建和Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系的建立

作者：李胜男; 陈吴海; 陈少凤; 邓福; 朱佩仪; 李友^*

来源：吉林大学学报(医学版), 2019, 45(06): 1224-1480.

DOI：10.13481/j.1671-587x.20190606

• RHBDF2
• RNA干扰
• 慢病毒
• HEK 293T细胞Neuro-2a细胞
• 稳转细胞系

目的:构建RHBDF2-shRNA慢病毒载体,建立Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系,并检测稳转细胞株中RHBDF2mRNA和蛋白表达水平。方法:根据NCBI提供的RHBDF2基因序列,设计并合成针对RHBDF2基因干扰靶点的shRNA-oligo,退火后将其连接到经EcoRⅠ和AgeⅠ酶切的慢病毒载体FV067-RNAiEGFP-Puro中,构建FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒,通过PCR筛选阳性克隆并测序鉴定。使用HEK293T细胞和Neuro-2a细胞作为实验材料,FV067Vector作为对照组,FV067-RHBDF2-shRNA作为实验组。通过Lipofectamine 2000将FV067Vector和FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒质粒分别与慢病毒辅助质粒psPAX2和pMD2G共转染至HEK 293T细胞中,转染48h收集并纯化慢病毒,分别将对照组FV067Vector和实验组FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒在感染复数(MOI)为50时感染Neuro-2a细胞,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达,采用2mg·L-1嘌呤霉素筛选出RHBDF2基因稳定沉默的细胞系。实时荧光定量PCR法检测2组细胞中RHBDF2mRNA表达水平,免疫印迹法检测2组细胞中RHBDF2蛋白表达水平。结果:PCR和测序,RHBDF2-shRNA慢病毒载体中的干扰序列与设计合成的RHBDF2-shRNA-oligo序列完全一致。FV067Vector慢病毒的滴度为5×108 TU·mL-1,FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒的滴度为3×108 TU·mL-1。实时荧光定量PCR检测,实验组稳转细胞株中RHBDF2mRNA表达水平比对照组降低了52.26%(t=11.44,P=0.007 6)。免疫印迹法检测,与对照组比较,实验组RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2蛋白表达水平降低了47%(t=6.374,P=0.007 8)。结论:成功构建了FV067-RHBDF2-shRNA慢病毒载体并建立了Neuro-2aRHBDF2-shRNA稳转细胞系,且Neuro-2a-RHBDF2-shRNA稳转细胞系中RHBDF2mRNA和蛋白表达水平明显降低。

• 单位
  中国热带农业科学院农产品加工研究所; 广东医科大学附属医院