桑树几丁质酶基因Machi1的克隆及原核表达

作者：肖圣燕; 朱峰; 冉瑞法; 李镇刚; 张永红; 邵榆岚; 唐芬芬; 白兴荣^*

来源：蚕业科学, 2019, 45(05): 634-642.

DOI：10.13441/j.cnki.cykx.2019.05.002

• 桑树
• 几丁质酶
• 基因克隆
• 原核表达
• 多克隆抗体

以桑品种云桑2号的健康叶片为材料,通过反转录PCR结合RACE方法克隆到桑树几丁质酶基因Machi1(GenBank登录号:MK783295)。Machi1基因的完整ORF序列长度为972 bp,编码323个氨基酸残基,预测Machi1蛋白分子质量为349kD,理论等电点(pI)为684。结构分析显示Machi1蛋白含有一个信号肽,无跨膜结构域。Machi1蛋白属于糖苷水解酶19家族,含有保守的ChtBD1结构域,预测具有几丁质酶活性。多序列比对结果表明,Machi1蛋白与川桑几丁质酶Mnchi19一致性最高为935%,系统进化树结果与之相一致。组织表达模式分析结果表明,Machi1基因在桑树叶片中的表达量最高。随后通过原核表达系统获得了重组目的蛋白并进行了纯化,用纯化的蛋白质免疫新西兰大白兔制备Anti-Machi1多克隆抗体。利用间接ELISA法测定其效价在1∶80 000以上,并经Western blotting验证了该多克隆抗体的特异性,为后续研究Machi1的抗病机制及生物学功能奠定了基础。

• 单位
  云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所