大鼠骨内膜骨髓细胞增殖和成软骨分化能力的体外研究

作者：曾文波; 兰生辉; 陈美玲; 袁功武; 孙再杰; 聂宇; 刘曦明

来源：华南国防医学杂志, 2018, 32(04): 215-220.

DOI：10.13730/j.issn.1009-2595.2018.04.001

• 表皮生长因子受体
• 骨内膜骨髓细胞
• 中央骨髓细胞
• 成软骨分化

目的对比骨内膜骨髓细胞(endosteal bone marrow cells,EBMCs)与中央骨髓细胞(center bone marrow cells,CBMCs)增殖及成软骨分化,为组织工程技术寻找较CBMCs更优良的种子细胞。方法取健康雄性SD大鼠的双侧股骨及胫骨,采用酶消化法分离EBMCs,采取密度梯度离心法分离CBMCs予体外增殖克隆,通过流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测细胞表面分子CD29、CD34、CD44、CD45的表达。集落形成单位(colony forming unit,CFU)检测细胞克隆形成,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,Brd U)检测细胞增殖能力,定量反转录-聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测细胞周期抑制因子相关基因p15、p16、p21、p27的表达。成软骨诱导培养21d后行阿尔新蓝染色并提取mRNA行qRT-PCR检测对比成软骨分化相关基因SOX9、aggrecan、Col2α1的表达。结果 EBMCs与CBMCs表面分子CD29、CD44均呈阳性表达,CD34、CD45均呈阴性表达,但EBMCs表达较CBMCs表达低,二者比较差异有统计学意义(P<0.05)。CFU检测中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及结晶紫染色可见EBMCs比CBMCs颗粒沉淀数量更多,颗粒直径更大。Brd U检测细胞增殖能力,可见CBMCs的荧光信号倍增量(1.47±0.16),明显低于EBMCs的荧光信号倍增量(2.56±0.36),二者比较差异具有统计学意义(P<0.001)。细胞周期抑制因子p15、p16、p21、p27的表达,EBMCs中分别为0.315±0.052、0.158±0.023、0.416±0.051、0.100±0.022,明显低于CBMCs的1.000±0.000、0.481±0.064、1.342±0.135、0.461±0.156,二者比较差异有统计学意义(P<0.001)。阿尔新蓝染色可见EBMCs成软骨分化后染色蓝染较CBMCs更明显;EBMCs中成软骨骨分化相关基因SOX9,aggrecan,Col2α1的表达分别为1.783±0.305、0.918±0.201、0.384±0.108明显高于CBMCs的1.000±0.000、0.297±0.082、0.124±0.007,二者比较差异均具有统计学意义(P<0.001)。结论 EBMCs较CBMCs有更强的增殖分化能力,更适合做软骨组织工程的种子细胞。

• 单位
  中国人民解放军陆军工程大学; 生物医学工程学院; 解放军武汉总医院; 南方医科大学