盖子环替换及定点突变提高菜豆环氧化物水解酶对邻甲基苯基缩水甘油醚的催化性能

作者：章晨; 朱秀秀; 李闯; 邬敏辰^*

来源：化工进展, 2020, 39(07): 2788-2794.

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2019-1727

• 菜豆环氧化物水解酶
• 邻甲基苯基缩水甘油醚
• 盖子环
• 丙氨酸突变
• 分子对接

菜豆环氧化物水解酶1和2(Pv EH1、Pv EH2)能够动力学拆分外消旋邻甲基苯基缩水甘油醚(rac-o MGE),从而保留(R)-o MGE。基于对Pv EH1和Pv EH2结构的同源模拟和分析,发现二者分子中的盖子环差异较大,故本文选择盖子环作为研究目标。经融合聚合酶链式反应(FPCR),获得了Pv EH2的盖子环区域被Pv EH1对应区域替换的杂合酶Pv2Pv1。用全细胞酶E. coli/pv2pv1催化rac-o MGE,当(S)-o MGE刚好水解完全时,产物(S)-3-邻甲苯基-1,2-丙二醇((S)-o TPD)的eep由Pv EH2的58.3%提高至75.5%。为进一步提高酶的性质,在Pv2Pv1中选取11个氨基酸位点进行丙氨酸(A)突变,获得最优突变子E. coli/pv2pv1K176A,活性为E. coli/pv2pv1(4.2U/g)的2.1倍,且当S构型的底物刚好完全水解时,(S)-o TPD的eep进一步提高为80.3%。分子对接分析发现,盖子环替换和K176位点突变为A,均使(R)-o MGE环氧环中的Cα更易受到酶中D101位点的攻击。利用E. coli/pv2pv1K176A催化150mmol/L rac-o MGE水解制备(R)-o MGE (ees>99%)和(S)-o TPD (eep=80.4%),二者的产率YS和YP分别为32.7%和60.1%,时空产率STYS和STYP为1.6g/(L·h)和3.3g/(L·h)。本实验为改善EH的催化性质提供了一种有效策略。

• 单位
  江南大学; 生物工程学院