蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2基因的克隆、表达及活性鉴定

作者：程超; 郭爱林; 巫国勇; 吴伟康; 罗红鹤; 钟佛添

来源：中山大学学报(医学科学版), 2007, 28(02): 137-141.

DOI：10.3321/j.issn:1672-3554.2007.02.004

• 蛋白酪氨酸磷酸酯酶
• 基因克隆
• 表达
• 纯化
• 质谱

【目的】获取人蛋白酪氨酸磷酸酯酶4A2(PTP4A2)基因并高效表达纯化,对于产物的体外活性进行测定。【方法】用RT-PCR技术,从肝癌细胞系HepG2的总RNA中,获得编码PTP4A2基因功能片段的DNA。测序后,通过酶切亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建重组表达载体,并导入大肠杆菌E.coliBL21中,IPTG诱导表达重组的GST融合蛋白。对重组融合蛋白过谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化,western印记进行鉴定,质谱检测蛋白分子量。通过其对底物磷酸多肽的去磷酸化反应,鉴定其活性。【结果】获得编码肝癌细胞PTP4A2(全长氨基酸)的基因序列,测序结果与已发表的基因序列相一致。重组GST融合蛋白经western分析,在相对分子质量Mr=45000处,有特异的蛋白条带。重组蛋白经谷胱甘肽琼脂糖柱进行纯化后,得到了高纯度的融合蛋白,质谱检测其分子量为45470.6。底物多肽去磷酸化反应表明纯化产物具有较强活性。【结论】成功克隆人PTP4A2基因,并在E.coliBL21中高效表达,亲和层析后获得高纯度GST融合蛋白,质谱检测分子量与预期结果一致,纯化产物具有蛋白磷酸酯酶活性。

• 单位
  广东省人民医院; 基础医学院; 中山大学; 中山大学附属第一医院